关于“单克隆抗体”中相关问题的探讨

陈颜

“单克隆抗体”是高中生物选修教材中“动物细胞工程”中的重点和难点，同时又是高考的必考内容。由于学生对免疫的相关知识欠缺，造成学生对这项现代生物技术即充满好奇又难以理解，做题时无从下手，错误百出。因而学生要达到课标要求的理解、综合应用水平，还需要教师对教材的内容加以拓展和加深，以帮助学生正确理解单克隆抗体的内涵，从而应对各类复杂的问题。

现就学习过程中，学生难以理解的知识点加以分析总结，以帮助学生正确理解相关知识。

1 传统制备抗体的缺点及理解

长期以来，人们为了获得抗体，传统的方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗體，然后从动物的血清中分离所需的抗体。这种方法不仅产量低，纯度低，而且制备的抗体特异性差。采用传统方法制备的抗体为什么产量低，纯度低，而且特异性差？

由于一种抗原可含有多个抗原决定簇，这种抗原决定簇可以隐藏在抗原内部，也可以暴露在抗原表面。因此当一种抗原注射到人或哺乳动物体内，相当于该抗原携带了若干种抗原决定簇进入机体。一个B淋巴细胞只能接受一种抗原决定簇的刺激，分化为相应的效应B淋巴细胞和记忆B淋巴细胞，并能产生与该抗原决定簇相结合的特异性抗体。即一种抗原决定簇只能引起一种特异性抗体。因而，一种复杂的抗原携带若干种抗原决定簇进入机体后，可刺激机体不同的B细胞分化产生多种抗体（图1）。即一种抗原引起机体产生多种特异性的抗体，这些抗体主要分布于血清。因此，从血清中分离的抗体纯度低、灵敏度低、特异性差。

2 单克隆抗体的制备过程中的相关疑点

问题一：如何用选择培养基筛选杂交瘤细胞？

在小鼠B淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合悬浮液中，放置了多个骨髓瘤细胞与多个多种B淋巴细胞，由于动物细胞融合是一个随机的过程，所以经融合后细胞将以多种形式出现。如果只考虑两两融合的情况，会有融合的骨髓瘤细胞—骨髓瘤细胞、B淋巴细胞—B淋巴细胞、B淋巴细胞—骨髓瘤细胞以及未融合成功的单个骨髓瘤细胞、单个的B淋巴细胞。那么如何从众多的细胞中筛选出杂交瘤细胞呢？

从众多类型的细胞中筛选出杂交瘤细胞，普遍采用的HAT选择性培养基，也就是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）。已知细胞中的DNA合成有两条途径。① 生物合成途径（“D途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。② 应急途径或补救途径（“S途径”），是利用次黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核苷转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，然后再合成DNA，两种酶缺一不可。

在D途径合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“D途径”。另一事实是人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。而鼠骨髓瘤细胞中虽然没有S途径，但能不断分裂增殖。

因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和B淋巴细胞—B淋巴细胞融合细胞的“D途径”被氨基喋呤阻断，虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10 d左右会死亡。而骨髓瘤细胞自身没有“S途径”，且“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。唯有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，在HAT选择性培养基上，既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖，这就是所需的杂交瘤细胞。

问题二：在得到杂交瘤细胞后，为什么还要进行再次筛选以及如何进行？

经过选择培养基筛选，得到的杂交瘤细胞不一定能产生所需的特异抗体。原因包括以下两个方面：① 经抗原处理过的机体脾脏中提取的细胞不一定都是效应B细胞，因而杂交瘤细胞不一定都能产生抗体；② 由于一种抗原刺激机体可使机体中存在多种浆细胞，所以杂交瘤细胞中有多种类型：AB1、AB2、AB3……它们产生的抗体不一定是所需的抗体，也不是单一的抗体。因此必须从多种杂交瘤细胞中筛选出能产生针对某一特定抗原决定簇的杂交瘤细胞。抗体的获得过程见图2。

通常采用专一抗体检验阳性的方法筛选出能产生针对某一特定抗原决定簇的杂交瘤细胞。首先将杂交瘤细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上，使每一孔含一个或几个杂交瘤细胞，根据抗体和抗原能发生特异性结合的特性去检测各孔的上清液中细胞分泌的抗体是不是所需要的，再保留或者舍去此孔杂交瘤细胞。通过这样的筛选，保留能与相应抗原发生特异性结合的杂交瘤细胞。然后，将这样的细胞进行大量的体内或体外培养，就可得到特异强性灵敏度高的单克隆抗体。

问题三：单克隆抗体为什么纯度高，特异性强，灵敏度高？

抗原注射到人和哺乳动物体内，相当于该抗原携带了若干个抗原决定簇进入机体。值得说明一下的是，在特异性体液免疫过程中，应该是一种抗原决定簇刺激一种B细胞，一种B细胞增殖分化成一种效应B细胞，一种效应B细胞产生一种具有特定抗原结合部位的抗体，此抗体可以与之相匹配的该抗原决定簇发生特异性结合。可见，在选择培养基上筛选出来的杂交瘤细胞实际上是多种B淋巴细胞和骨髓瘤细胞形成的多种杂交瘤细胞，每种杂交瘤细胞都分泌不同的抗体。再经过专一抗体检验阳性后，就筛选出能分泌和该抗原的某一特定抗原决定簇特异性结合的杂交瘤细胞，此时的杂交瘤细胞只有一种，即能无限增殖又能分泌一种抗体。这些抗体均只识别同一种抗原决定簇，因而特异性强、灵敏度高。又由于这种杂交瘤细胞能无限增殖，后代细胞数量多，所以分泌的抗体量多，可大量制备。

参考文献：

陈阅增.普通生物学[M].北京：高等教育出版社，1997：180.