葛根素衍生物4ac对胶原诱导性关节炎大鼠血液流变学的影响*

董鑫鑫，高书亮，肖 诚，赵宏艳，王 燕，吕 诚，杨大坚，吕爱平△

(1.中国中医科学院中医临床基础研究所，北京 100700;2.江西中医学院，江西南昌 330004;3.中日友好医院临床医学研究所，北京 100029;4.中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700;5.香港理工大学深圳现代中药研究所，广东深圳 518000)

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性、对称性、多发性并以关节损害为表现的自身免疫性疾病，其早期病变主要在滑膜。目前尚无特效药物，常用的有非甾体抗炎药、糖皮质激素、青霉胺、免疫抑制剂等药物，但均存在一定的毒副作用，因此科研工作者一直致力于寻找新型的治疗类风湿性关节炎药物。

葛根素是从豆科植物野葛的干燥根中提取并分离出来的一种异黄酮化合物，其具有扩张血管、改善微循环、抗血小板凝集等作用，临床上常用于治疗冠心病、心绞痛及脑血栓等疾病[1]。研究发现[2～4]，RA患者及动物模型均出现微循环和血液流变学方面的异常，因此葛根素是否对类风湿性关节炎有治疗作用，是本研究所关注的问题。葛根素的衍生物—葛根素经乙酰化反应生成的衍生物(4ac)是对葛根素化学结构进行了一系列的修饰，其稳定性和生物利用度都较葛根素明显提高[5～7]。本实验主要观察其对CIA大鼠的治疗作用及其对血液流变学的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体重160g±10g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级动物室喂养，实验动物室许可证号SYXK(京)2005-0024。

1.1.2 主要药物与试剂 葛根素衍生物4ac由香港理工大学杨大坚教授提供，经HPLC法测定含量均在98%以上;乌拉坦:北京化学试剂公司，批号040427;枸橼酸钠:北京化工厂，批号950207;ADP:美国Sigma公司，批号951104;凝血酶(FIB):上海太阳试剂公司，批号136011;II型胶原(CII)、不完全弗氏佐剂(IFA):美国Chondrex公司产品，批号070347、080073。

1.1.3 主要仪器 LBY-W6A型自清洗旋转式黏度计、LBY-NW1型毛细管黏度计、C2000-4血凝仪(北京普利生仪器公司);PA-3210型血小板聚集仪(日本DIC公司);KH-120A微量毛细管离心机(日本);LXJ-Ⅱ离心机(上海医用分析仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 实验开始第1天取适量大鼠Ⅱ型胶原，将其溶于0.1M乙酸配成浓度为2 mg/mlⅡ型胶原溶液，4℃过夜。此溶液再与等量不完全弗氏佐剂混合，充分乳化后以滴加于水中不扩散为度，取乳化后的混合物按200μgⅡ型胶原/只大鼠，于尾根部皮下免疫，1周后按100μgⅡ型胶原/只于尾根部皮下加强免疫1次。正常组以等量生理盐水于尾根部进行皮下假免疫。

1.2.2 分组与给药方法 随机分为空白对照组、模型组、地塞米松组、4ac高剂量组、4ac低剂量组5组，每组12只。于免疫12d开始腹腔注射给药，每天1次，连续4周。给药剂量如下:DEX组0.2mg/kg·d[8]、4ac 低剂量 45mg/kg·d、4ac 高剂量组90mg/kg·d，空白对照组和模型组腹腔注射等量的生理盐水。造模当天测量动物体重，以后每3d测量1次。

1.2.3 关节炎指数(Arthritis Index，AI)的计算致炎后第12天开始观察并记录全身关节病变程度，每3d 1次。采用0～4级关节评分法[9]。0分:无红肿;1分:小趾关节红肿;2分:趾关节和足跖肿胀;3分:踝关节以下的足爪肿胀;4分:包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把2只后踝关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AI，每个动物最大为8分。

1.2.4 血液流变学的检测方法 给药4周后，乌拉坦麻醉下，采用腹主动脉方法取血，部分取全血用于血液流变学指标检测。

红细胞压积测定:用微量毛细管吸入一定量的全血，高速离心机12000rpm/min，离心15min，专用计数板读出红细胞压积百分数;全血黏度测定:将700μl全血缓慢加入旋转黏度仪测定杯中，37℃预温1min，测定 50s－1和 200s－1的全血黏度;血浆黏度测定:200μl血浆吸入毛细管中，测定37℃时的血浆黏度;血浆纤维蛋白原(FIB)含量测定:采用Clauss凝固法原理按试剂盒说明书方法在PRECIL C2000-4血凝仪上测定。

2 结果

2.1 大鼠体重变化

表1 各组大鼠体重的变化(s，n=12)

表1 各组大鼠体重的变化(s，n=12)

注:与正常组比较:*P<0.05;与正常组比较:**P<0.01;与模型组比较:#P<0.05;与模型组比较:##P<0.01(下同)

组别 第1天 第12天 第21天 第30天 第39天0±21.11 402.50±29.29模 型 组 161.92±7.24 255.92±15.31 258.17±28.83** 296.58±36.63* 331.75±41.95*地 塞 米 松 组 162.58±6.54 262.50±15.26 256.75±19.22** 267.75±18.03* 275.58±22.10*##4 ac 高 剂 量 组 162.25±6.12 253.75±21.71 266.17±31.62** 291.16±37.07* 307.83±47.88*4 ac 低 剂 量 组 162.58±5.30 257.50±17.96 272.91±33.75** 300.92±45.33* 326.50±54.56空 白 对 照 组 164.70±6.51 271.30± 9.33 327.20±12.43 368.2*

第21天模型组、地塞米松组、4ac高剂量组、4ac低剂量组与空白对照组比较明显降低(P<0.01);第39天地塞米松组与模型组相比，体重明显降低(P<0.01)，但4ac高剂量组、4ac低剂量组和模型组相比，没有显著性差异。

2.2 大鼠AI变化

第15天与模型组比较，地塞米松组积分明显降低(P<0.01)，第21天起动物关节没有肿胀;第39天和模型组比较，4ac高剂量组积分明显降低(P<0.01)，而4ac低剂量组则无显著变化。

2.3 各组动物血流变学指标的变化

模型组和空白对照组相比，红细胞压积、血浆黏度和全血黏度(低切)均明显增加(P<0.01)，纤维蛋白原含量和全血还原黏度(高切)无显著性差异;与模型组比较，地塞米松组能明显降低红细胞压积、全血黏度(高切和低切)和全血还原黏度(高切和低切)(P<0.01);4ac高剂量组能明显降低红细胞压积、全血黏度和全血还原黏度(P<0.01);4ac低剂量组能明显降低全血黏度(低切)和全血还原黏度(P<0.01)。

表2 各组大鼠AI的变化(s，n=12)

表2 各组大鼠AI的变化(s，n=12)

组别 第12天 第15天 第21天 第30天 第39天5±2.22地 塞 米 松 组 4.72±2.23 0.62±0.51## 0## 0## 0##4 ac高 剂 量 组 4.78±2.54 4.83±2.82 5.67±2.99 3.83±2.48 2.50±1.57##4 ac低 剂 量 组 4.81±2.78 4.92±2.97 5.25±3.60 5.50±3.50 4.6模 型 组 4.91±2.65 5.25±2.45 5.83±3.38 4.67±3.11 4.2 7±2.99

表3 各组动物血流变学指标的改变(s，n=12)

表3 各组动物血流变学指标的改变(s，n=12)

组别 红细胞压积(%)纤维蛋白原含量(g/L)血浆黏度(mpa.s)全血黏度(mpa.s)全血还原黏度(mpa.s)50s－1 200s－1 50s－1 200s －1±0.13 14.86±1.53 5.90±0.32模 型 组 49.5±2.50** 3.10±0.34 0.99±0.04** 8.06±1.17** 3.65±0.33* 14.48±2.02 5.45±0.43 DEX 组 45.7±1.97## 3.33±0.40 0.99±0.03 6.11±0.99### 3.15±0.28### 13.88±1.64### 4.92±0.29###4 ac高 剂 量 组 45.23±4.43## 3.55±0.47 0.99±0.04 6.30±1.02### 3.19±0.27### 11.81±1.52### 4.93±0.39###4 ac低 剂 量 组 48.79±1.56 3.38±0.54 0.99±0.05 6.94±0.65### 3.32±0.21### 12.38±1.56### 4.86±0.59空 白 对 照 组 46.9±2.80 3.1±0.22 0.95±0.03 7.57±0.68 3.57##

3 讨论

类风湿性关节炎属中医学“痹证”范畴，其病因病机是人体正气虚弱，风寒湿邪侵袭人体，正气为邪所阻，导致气血凝滞，久而成痹。现代医学研究表明[2～4]，RA患者可有微循环和血液流变学方面等异常，分析其原因主要与血管内膜炎症及血液黏度增高有关，这些因素共同作用促成血栓形成，栓塞四肢微小血管，导致RA病人四肢血液循环障碍的诸项临床症状。目前，CIA模型在临床表现、病理组织学及体液免疫反应方面与人RA接近，是研究人类类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病的常用动物模型。实验研究表明，CIA模型组动物的全血黏度、血小板聚集率、纤维蛋白原参数均高于空白对照组，表明有高黏、血瘀存在。

葛根素系异黄酮类，为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd1)Ohwi1或甘葛藤Pueraria thomsonii Bent h.的主要有效成分。研究表明，葛根素对血液流变学指标具有一定的改善作用。高尔等研究发现，葛根素对家兔红细胞压积、全血比黏度、血沉等血液流变学指标有改善作用，能抑制肾上腺素诱导的人和动物的血小板聚集。

在本实验中，表1显示大鼠体重在第21天，模型组、地塞米松组、4ac高剂量组、4ac低剂量组与空白对照组比较，体重均有明显下降，说明造模可以使大鼠体重增长幅度下降。经过1个月的治疗，4ac高剂量组已改善了CIA模型大鼠的关节肿胀和血液流变学部分指标，但均未对体重产生明显影响。

表2显示，在第15天即给药3d后，地塞米松组动物的关节积分较其他各组比较有极显著性意义，在第39天4ac高剂量组动物关节积分较模型组也明显降低。这说明激素对类风湿性关节炎有较好的治疗作用，而4ac高剂量对类风湿性关节炎关节肿胀度也有一定的改善作用。

血液流变学主要是反映由于血液成分变化而带来的血液流动性、凝滞性和血液黏度的变化，血液流变性质的异常，将会引起机体血液循环障碍。本实验所采用的CIA大鼠的血液流变学红细胞压积、血浆黏度和全血黏度均明显高于空白对照组，纤维蛋白原和全血还原黏度模型组与空白对照组无显著性差异(P>0.05)，4ac高、低剂量组均能显著降低红细胞压积、全血黏度和全血还原黏度。王跃民等报道，低切变率下的血液黏度与红细胞聚集指数关系密切，其值的升高常常反映红细胞聚集程度较高，红细胞变形能力则主要影响高切变率下的全血黏度，高切变率下的全血黏度降低，与红细胞变形能力增强有关。红细胞压积是形成血液黏度的重要因素，血液黏度随红细胞压积呈指数变化。该实验结果提示，该药可能是通过降低CIA大鼠全血黏度和全血还原黏度等作用，来抑制红细胞聚集，改变模型大鼠血液“浓、黏、聚、凝”的状态，改善血液流变性，4ac对CIA大鼠血液流变学部分重要指标有明显改善作用，可能是该药治疗RA的药理基础之一。

本文研究表明，4ac高剂量能有效降低动物的关节肿胀程度，明显改善血液的高凝状态，改善微循环，提示4ac高剂量对CIA关节炎有一定的治疗作用，但其具体机制有待于进一步研究。

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