DMN诱导的肝纤维化模型伴肾损害的实验观察

胡志峰，李 忻，何 燕，李 平△，肖 诚，潘 琳，郭景珍，张浩军，路晓光，杨 鑫，张 韫

(1.中日友好医院临床医学研究所，北京 100029;2.江西中医学院，江西南昌 330006)

中医学认为“肝肾同源”、“肝肾互补”，肝肾两脏关系至为密切，但相关的物质基础目前尚不清楚。为了深入研究“肝肾同源”的病理生理机制，我们首次建立了二甲基亚硝胺(DMN)诱导的大鼠肝纤维化伴肾损伤复合动物模型。DMN具有明确的致肝纤维化作用，但是在肾损伤中的研究国内还未见报道。本实验旨在研究复合动物模型的同时，探讨肝肾相关的可能物质基础，为指导临床治疗提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性SD大鼠16只，SPF级，体重80g±10g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2002-0003号。

1.2 药物与试剂

DMN购自日本东京化成工业株式会社。透明质酸(hyaluronicacid，HA)、层黏连蛋白(laminin，LN)和Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)检测试剂盒购自北方生物技术研究所。

1.3 仪器

全自动生化分析仪(美国CD-1600);BFG0152型放射免疫λ计数仪(北京核仪厂);滑走式切片机(日本SAKURA公司);显微镜(日本OLYMPUS公司);Image Pro Plus(IPP)Version 5.0图像分析软件。

1.4 分组及模型制备

将动物随机分为2组，正常组、模型组各8只。参照金树根等[1]的方法，DMN用生理盐水稀释成0.5%的浓度，以2 ml/kg的用量腹腔注射，每日1次，每周2次，共4周。正常组给予等剂量的生理盐水腹腔注射。实验结束用3.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取血，离心获得血清待测;取大鼠肝、肾组织，4%中性多聚甲醛缓冲液固定备用。

1.5 检查项目

全自动生化仪检测血清AST、ALT、BUN、SCr含量，放免试剂盒检测纤维化指标HA、LN和Ⅳ-C水平。

1.6 病理染色

肝、肾组织经4%多聚甲醛缓冲液固定，石蜡包埋，制备成4μm厚度切片。肝脏做HE、MASSON、天狼星红染色，肾脏做HE、PAS、天狼星红染色。采用IPP5.0软件对肝肾天狼星红染色的图像分析定量。

1.7 免疫组化

肝、肾组织石蜡切片，用Envision二步法检测TGF-β1、α-SMA的分布与表达，采用 IPP5.0软件对图像分析定量。

1.8 图像分析

显色结果采用IPP5.0图像分析软件，肾组织TGF-β1免疫组化染色每个切片随机取10个肾小球，图像放大400倍，测量阳性表达和肾小球面积，计算其比值并取平均值[2]。其他图像分析指标每张切片随机取5个视野，图像放大200倍，测量阳性染色面积，取平均值并计算其占视野面积的百分数。

1.9 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件，所有计量资料以均数±标准差(s)表示，组间均数差异用单因素方差检验进行分析，以P<0.05作为判定有显著性差异的标准。

2 结果

2.1 对血清肝肾功能的影响

表1显示，模型组大鼠血清ALT、AST含量明显上升，与正常组相比差异显著(P<0.01，P<0.05);Scr、BUN含量亦明显增高，与正常组相比有显著差异(P<0.05，P<0.05)。

2.2 血清纤维化放免检测结果

表2显示，模型组LN、Ⅳ-C和HA水平明显升高，与正常组相比差异显著(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

表1 DMN对大鼠血清肝肾功能的影响(n=8)

表2 DMN对大鼠血清LN、HA、Ⅳ-C水平的影响(ng/ml，n=8)

2.3 对组织的影响

肝组织:正常组肝小叶结构完整，无变性、坏死，无炎性细胞浸润及纤维增生。模型组可见，肝细胞索排列紊乱，炎症比较明显，肝小叶结构破坏，汇管区及中央静脉纤维组织增生，汇管区－中央静脉区形成宽大的纤维间隔，假小叶形成(见图1～3)。

肾组织:正常组肾小球形态、结构正常。模型组在血管间质可见小灶状炎细胞浸润，特别是在大的血管周边部，并可见散在点状坏死灶，基底膜轻度增厚，肾小管间质可见胶原增生明显(见图4～6)。

图1 肝脏HE染色(×200)

图2 肝脏MASSON染色(×200)

图3 肝脏MASSON染色(×200)

图4 肝脏天狼星红染色(×200)

图5 肾脏PAS染色(×400)

图6 肾脏天狼星红染色(×400)

2.4 天狼星红染色胶原面积图像分析结果

表3显示，在肝脏和肾脏，模型组较正常组胶原增生明显(P<0.01)。

2.5 免疫组化图像分析定量结果(见表4)

表3 天狼星红胶原面积图像分析结果(n=8)

表4 TGF-β1，α-SMA 免疫组化结果(%，n=8)

2.5.1 TGF-β1的表达 肝组织:正常组仅见于汇管区、中央静脉周围细胞有表达，且着色较浅、范围窄。模型组则在汇管区、中央静脉周围及纤维间隔内有大量表达，呈棕黄色颗粒状，范围广，着色深(P<0.01)(见图7)。

肾组织:正常组在肾小球有一个较弱的阳性表达，而模型组肾小球阳性表达明显增多(P<0.01)(见图8)。

2.5.2 α-SMA的表达 肝组织:正常组只在汇管区、小叶中央静脉及分散在组织间的成纤维样细胞中出现。模型组在肝实质损伤区域大量出现，包括汇管区、肝纤维隔及肝窦等(P<0.01)(见图9)。

肾组织:正常组只在血管壁上有表达，模型组在血管壁及小管周边间质部分均有表达，局部有的阳性表达彼此连结成一些小的不完整的网状结构，呈细丝状，甚至包绕肾小球(P<0.01)(见图10)。

图7 肝脏 TGF-β1免疫组化(×200)

图8 肾脏 TGF-β1免疫组化(×400)

图9 肝脏α-SMA免疫组化(×200)

图10 肾脏α-SMA免疫组化(×400)

3 讨论

肝肾同源是中医的藏象理论，数千年来一直指导临床的辨证和治疗。早在《内经》中就有“肾生骨髓，髓生肝”的论述，明代医家李中梓结合自己的临床经验在《医宗必读》中首次提出著名的“乙癸同源”、“肝肾同治”的观点。“乙癸同源”是指肝、肾的结构和功能虽有差异，但其起源相同，密切相关。在先天，肝肾共同起源于生殖之精;在后天，肝肾共同受肾所藏的先后天综合之精的充养，“肾生骨、髓，髓生肝”。“肾生骨、髓”，即肾生“骨”和“髓”，“髓”又分“骨髓”、“脊髓”、“脑髓”、“精髓”等，它们均由肾精化生，“藏真下于肾，肾藏骨髓之气也”(《素问·平人气象论》);肾为肝之母，肝为肾之子。“髓生肝”，即肾通过“髓”生养肝而发生母子联系。“源”又可理解为事物之间相关联的中心环节，故“乙癸同源”又即肝肾的结构和功能体系通过某些中心环节而密切相关。“肝肾同源于精血”，意即肝肾的结构和功能体系通过“精血”这一中心环节而密切相关。简而言之，“乙癸同源”即“肝肾相关”，是人体内肝肾结构和功能协调统一的整体调控机制[3]。中医“肝肾同源”反映了肝肾两脏生理、病理和物质属性的同一性，预示了肝肾两脏可能有相同生物活性物质和靶细胞[4、5]。近年来不少学者对这一理论进行了深入研究。

DMN常用来建立肝纤维化模型，具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性，其活性代谢产物使核酸、蛋白质等重要的生命物质发生甲基化反应，随后导致肝细胞坏死或凋亡，细胞外基质(ECM)进行性增加[6]。由于肝、肾纤维化具有一些内在的共同发病规律和病理形态学特征，如均表现为致纤维化的细胞因子表达上调，ECM合成增多或降解减少，纤维过度增生等[7]，由此我们在腹腔注射DMN诱导动物肝纤维化的同时，观察了其对肾损伤的影响。实验结果表明，模型组大鼠血清转氨酶酶活性增强，血清肝纤维化指标LN、HA和IV-C水平显著升高，肝组织结构破坏，假小叶形成。同时还首次发现，DMN能够诱导大鼠肾功能改变，血清SCr、BUN水平升高，肾小管间质可见炎性浸润，胶原增生明显。

我们进一步采用免疫组化方法对肝肾α-SMA、TGF-β1的表达进行了研究，探讨肝纤维化伴肾损伤时的作用机制。大量文献证实，肝脏中α-SMA是肝星状细胞(HSC)活化、指示病程进展的重要标志[8]。而TGF-β1为公认的致肝纤维化最主要的细胞因子之一，主要通过自分泌和旁分泌方式参与活化、促进合成、抑制基质降解来参与肝纤维化发展过程[9]。在肾脏中，α-SMA阳性的肌成纤维细胞是导致ECM过度沉积的主要细胞来源。TGF-β1表达升高与多种原因引起的肾纤维化密切关系，它与受体结合通过细胞内信号转导活化靶基因产生一系列靶蛋白，使肌成纤维细胞增多，促进肾小球硬化和间质纤维化的发生[10～11]。本研究显示，模型组大鼠肝肾α-SMA和TGF-β1表达显著升高。

综上所述，本文首次在DMN模型大鼠中观察到肝纤维化并伴有肾损害，其机制可能是通过上调α-SMA和TGFβ1的表达而引起。这一方面为肝肾同源的病理相关性提供了实验依据，另一方面似可认为α-SMA和TGF-β1可能是肝肾相关的重要物质基础，为临床和科研提供了有效的药物筛选方法与治疗思路。

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