四君子汤对小鼠侵袭性肺曲霉病作用的实验研究＊

罗闳丹，杨 芬，施 旻，谢小梅

(江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌 330004)

侵袭性肺曲霉病(invasivepulmonary aspergillosis，IPA)是免疫力低下患者烟曲霉菌感染的最常见类型，其死亡率高达80% ～90%，预后很差。目前临床上用于治疗烟曲霉感染的药物主要是化学合成类药物，如两性霉素B及其衍生物、唑类化合物、烯丙胺类等，它们对IPA的作用主要是通过直接抗烟曲霉菌而起效，这些药物的毒副作用大、易产生耐药性且价格昂贵，临床应用受到限制，且单纯的抗真菌药物常难以奏效，因此调节、恢复或重建机体的免疫功能可能是根本措施。

研究表明，传统的补益方剂如十全大补丸、四君子汤及当归补血汤等，在治疗深部真菌感染特别是白色念珠菌深部感染有一定的效果，但对烟曲霉深部感染的实验治疗研究较少。四君子汤作为传统的补益方剂，能明显改善机体免疫功能，临床应用广泛，迄今未见其对侵袭性肺烟曲霉病作用的实验报道。本研究拟通过建立IPA小鼠模型，灌胃四君子汤，观察其对IPA小鼠的影响，为中药补益方剂用于治疗难治性IPA积累实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

四君子汤购自江西省中医院，按传统组方配制:党参9g，白术9g，茯苓9g，炙甘草6g。实验前制成50%、100%、200%水煎剂备用。

实验动物:清洁级昆明系小鼠，5周龄，体重为22g±2g，雄性，由江西中医学院动物实验中心提供。

酮康唑(TCZ)由西安扬森制药有限公司生产，口服片剂(060421199);环磷酰胺(cy)由江苏恒瑞医药股份有限公司生产(06060521)。

烟曲霉菌:购于中国医学真菌中心(南京)(为临床分离菌株，编号为3910);蔡氏培养基:参考文献制备。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 将小鼠随机分为7组:A组(n=5):正常组(正常健康小鼠);B组(n=5):免疫抑制组(仅注射环磷酰胺小鼠);C组(n=15):正常+接种烟曲霉组(不注射环磷酰胺但接种烟曲霉小鼠);D组(n=15):模型组(免疫抑制并感染烟曲霉菌小鼠);E组(n=15):低剂量四君子汤治疗组(给予50%四君子汤灌胃的IPA小鼠);F组(n=15):中剂量四君子汤治疗组 (给予100%四君子汤灌胃的IPA小鼠);G组(n=15):高剂量四君子汤治疗组(给予200%四君子汤灌胃IPA小鼠);H组(n=15):阳性对照组(给予酮康唑灌胃的IPA小鼠)。

1.2.2 小鼠IPA模型建立

诱导免疫抑制:各组小鼠腹腔注射cy200mg·kg·d，A、C组腹腔注射相同剂量生理盐水，连续注射2d，测定小鼠淋巴细胞百分率、巨噬细胞数、脾细胞数及胸腺和脾脏的重量。

建立IPA小鼠模型:将烟曲霉菌活化2次后收集菌液，烟曲霉孢子悬液制备成孢子浓度为107个/ml。乙醚麻醉小鼠，加样枪吸取孢子悬液50μl滴入鼻孔，使之被动吸入肺部。

1.2.3 给药方法 四君子汤治疗组从烟曲霉菌吸入当天开始给药，每日灌胃1次，每日O.5ml，连续给药1周。另设酮康唑阳性对照组:酮康唑(TCZ)按小鼠体表面积折算其用量，剂量为30mg·kg·d，其余各组灌胃同等剂量生理盐水。

1.2.4 小鼠各脏器烟曲霉培养 各组小鼠灌胃7d后，于第8天处死，无菌取肺、肝、脾、肾组织碾磨，在蔡氏固体培养基上培养4d～6d，计数菌落数。

1.2.5 各脏器的病理切片观察 于第8天无菌取小鼠肺、肝、脾、肾用福尔马林固定做石蜡切片，分别用HE和PAS常规染色。镜下观察各组织的病理改变情况。

1.2.6 生存保护实验 另取清洁级昆明系小鼠90只，随机分成6组，即正常组+烟曲霉接种组、模型组、低剂量四君子汤治疗组、中剂量四君子汤治疗组、高剂量四君子汤治疗组和阳性对照组。从接种烟曲霉开始连续4周观察小鼠生存情况。

1.3 数据统计分析

所有数据用SPSS统计分析软件处理，t检验法进行组间差异显著性分析。

2 结果

2.1 环磷酰胺诱导的免疫抑制

表1显示，小鼠腹腔连续2d注射环磷酰胺200mg·kg·d，与正常组小鼠比较，脾脏和胸腺重量下降，脾细胞数、腹腔巨噬细胞数及外周血淋巴细胞百分比显著降低，差异有显著性意义(P<0.05)，说明小鼠连续2d腹腔注射环磷酰胺200mg·kg·d能有效诱导免疫抑制。

2.2 小鼠各组织烟曲霉培养情况

表2、图1～图5显示，正常组+烟曲霉菌接种组与IPA模型组的肺、肝组织菌落数差异有显著性意义(P<0.05);各治疗组与IPA模型组的肺、肝组织菌落数差异有显著性意义(P<0.05)，且烟曲霉色素明显减弱;四君子汤低剂量组分别与中、高剂量组及阳性对照组比较，肺、肝组织的烟曲霉菌落数差异有显著性意义(P<0.05);中、高剂量组分别与阳性对照组比较，肺、肝组织的烟曲霉菌落数差异无显著性意义(P>0.05);脾、肾组织烟曲霉培养的菌落数都较少，各组之间差异无显著性意义。

表1 环磷酰胺给药组与正常对照组免疫指标的比较(±s，n=5)

表1 环磷酰胺给药组与正常对照组免疫指标的比较(±s，n=5)

注:与正常组比较:★P<0.05

组 别 剂量(mg·kg －1·d －1)时间(d)脾脏重量(g)胸腺重量(g)淋巴细胞百分比(%)脾细胞数(106)腹腔巨噬细胞数(106)正 常 组 0 2 0.1044±0.0431 0.0484±0.0211 81.74±7.63354.83±7.144 7.221±1.544 CY 组 200 2 0.0378±0.0674★ 0.0173±0.0073★ 37.54±6.674★ 5.883±0.996★ 0.754±0.3852★

表2 各组小鼠肺、肝、脾、肾组织烟曲霉菌落数比较(±s)(单位:个/ml)

表2 各组小鼠肺、肝、脾、肾组织烟曲霉菌落数比较(±s)(单位:个/ml)

注:与IPA模型组比较:★P<0.05，☆P>0.05;与四君子汤低剂量组比较:▼P<0.05，▽P>0.05;与阳性对照组比较:◇P>0.05

组别剂量 菌落数肺肝脾肾正常+烟曲霉菌接种组 —IPA模型组 —50%水煎剂 0.5ml/d四君子汤治疗组 100%水煎剂 0.5ml/d 200%水煎剂 0.5ml/d阳性对照组(酮康唑)9.0± 0.41★ 3.0±0.55★ 5.0±0.55☆ 6.5±0.80☆30mg/kg/d 102.0±14.06 56.0±8.64 13.0±1.51 9.0±1.12 47.0± 3.91★ 21.0±2.49★ 6.5±0.83☆ 8.0±0.54☆16.0± 2.58★▼◇ 10.0±1.47★▼◇ 10.5±1.16☆▼◇ 6.5±0.80☆▼◇20.5± 2.60★▼◇ 12.0±1.88★▼◇ 8.0±1.51☆▼◇ 4.5±0.69☆▼◇24.5± 2.42★▼ 17.0±1.34★▼ 9.0±0.69☆▼ 9.0±1.24☆▼

2.3 各脏器的组织病理变化情况

图6～图9显示，镜下见IPA模型组的肺组织有大量菌丝团，伴有坏死及大量炎细胞浸润，并可见部分气管上皮细胞坏死脱落;肝组织内见肝窦扩张，肝细胞水肿，部分细胞脂肪变性;肾组织血管充血，部分肾小球囊腔消失。低浓度四君子汤组肺组织见少量菌丝，间质明显增生，气管周围淋巴细胞浸润明显，有小灶性出血;肝细胞水肿明显，肝内可见多处灶状炎细胞浸润，并有巨噬细胞增生，肾脏未见明显病变。中浓度和高浓度四君子汤组肺组织未见菌丝，肝细胞轻度水肿脂肪变性，肾脏除有轻度充血外基本正常。

图1 ～图5 各组肺组织烟曲霉培养情况

图6 ～图9 各组肺组织病理变化

2.4 小鼠生存实验

表3显示，低剂量、中剂量、高剂量组和阳性对照组小鼠的存活率均高于IPA模型组，其中中剂量组小鼠的存活率和生存质量明显高于IPA模型组，且高于低剂量、高剂量和阳性对照组。

表3 各组小鼠生存率比较

3 讨论

侵袭性肺曲霉病常发生于有明显免疫缺陷的患者中，特别在器官移植、中性粒细胞缺乏、接受免疫抑制剂、皮质类固醇治疗的患者中尤为常见，正常人群不易感染烟曲霉。中医理论认为，“正气存内，邪不可干”。所谓正气，一般指正常的免疫功能，正气虚则免疫功能低。正气强弱是疾病发生与否的根本原因，并在疾病的发展变化及转归中起主导作用［5］。当机体正气不足时，通过扶正以提高和调节机体的免疫功能，达到排除和抑制病邪的目的。

本实验发现，正常小鼠接种烟曲霉组4周后的存活率为100%，IPA模型组4周后的存活率仅为26.7%，中剂量四君子汤治疗组4周后的存活率为60%，提示提高机体的免疫力对预防和治疗侵袭性肺曲霉病有极其重要的意义。

四君子汤原出于宋·《太平惠民和剂局方》，方药组成有党参、炙甘草、茯苓、白术4味药物。根据“脾居中州”、“脾虚易生湿”、“湿重易伤脾”的中医理论组方遗药，用补益中气的药物治疗脾虚，佐以祛湿之品以助健脾之功，诸药合用，共奏健脾益气之功。中医理论认为，脾为后天之本，“脾旺不受邪”，四君子汤对特异性和非特异性免疫功能的增强作用是其补脾益气功效的药理基础。

本实验通过给予IPA模型小鼠低、中、高不同剂量的四君子汤，发现其肺组织的病理结果均有不同程度的改善，其中以中剂量组最佳;各组织的烟曲霉培养结果也显示，给予四君子汤组的菌落数明显少于IPA模型组且烟曲霉的色素明显减弱;同时生存实验还发现，中剂量四君子汤治疗组能明显提高IPA模型小鼠的生存时间，改善生存质量。提示四君子汤对IPA模型小鼠有一定的治疗作用，其作用机制研究是我们下一步要做的工作，特别是从免疫学方面通过细胞和分子生物学技术做更深入的研究探讨，为中药补益方剂治疗难治性IPA奠定了一定的理论基础。