黄芩茎叶总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤的实验研究＊

龚明玉，闫凤霞，刘永平，金晓萍，杨鹤梅

(1.承德医学院生物化学教研室，河北承德 067000;2.承德医学院附属医院病理科，河北承德 067000)

心肌缺血再灌注损伤(Myocardium ischemia reperfusion injury，MIRI)是临床常见的病理过程，随着急性心肌梗死再灌注治疗的普及而备受重视。心肌缺血再灌注损伤与细胞凋亡密切相关，其中心环节是自由基等所致脂质过氧化损伤。黄芩茎叶总黄酮(Scutellaria Baicalensis stem-leaf Total Flavonoid，SSTF)是本院重点实验室—中药研究所研究开发的黄酮类化合物，具有抗氧自由基及抗心肌缺血、保护心肌的作用。本实验通过大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探讨SSTF是否对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。

1 材料

1.1 药物

SSTF纯度为61.8%，批号010608，由本院省重点实验室——中药研究所提供，用饱和NaHCO3溶解后灌胃。LDH、SOD、MDA检测试剂盒购自南京建成生物工程所。

1.2 动物

健康SD大鼠40只，体重230g±20g，雌雄各半。

2 方法

2.1 动物分组及处理

40只SD大鼠随机分为SSTFⅠ组、SSTFⅡ组、SSTFⅢ组、缺血再灌注组和假手术组5组，每组8只。其中SSTF 3组大鼠于手术前1周分别灌胃不同剂量的 SSTF(17.5mg/kg/d、35mg/kg/d、70mg/kg/d)，连用7d;缺血再灌注组和假手术组大鼠术前分别给予相应容积的生理盐水，时间同SSTF组。

2.2 心肌缺血再灌注模型的制备

10%乌拉坦腹腔注射麻醉(1ml/100g)，仰卧位固定，用针型电极插入大鼠四肢皮下记录标准肢体II导联心电图。于胸骨左缘3～4肋间切开胸壁，暴露心脏。①心肌缺血再灌注组:在左心耳与肺动脉干之间结扎左冠状动脉的前降支，同时在结扎线与血管之间穿一直径2mm长5mm的硅胶管，结扎30min;然后剪断缝合线，取出硅胶管，再灌注2h;②假手术组:仅分离前降支并穿过丝线，但不结扎;③SSTF组:手术前给予不同剂量SSTF灌胃(17.5 mg/kg/d、35mg/kg/d、70mg/kg/d)，连用 1 周，结扎30min，再灌注 2h。

2.3 取材

实验结束后，颈总动脉取血3ml，分离血清置－20℃冰箱保存待测。取血后迅速取出心脏，置冰冷盐水中冲洗残血，一部分置于－20℃冰箱保存，另一部分用70%乙醇固定。

2.4 指标检测

2.4.1 流式细胞方法测定细胞凋亡率 将70%乙醇固定的心肌组织用机械法分离，收集单细胞悬液，经100目尼龙网过滤离心，沉淀5min，加PBS洗涤，再次离心沉淀后，用溴化乙锭一步插入法进行DNA染色，由流式细胞仪测定。将所得数据输入计算机，经Cell quest软件处理，分析细胞的凋亡率。

2.4.2 血浆乳酸脱氢酶(LDH)活性测定 按试剂盒说明书进行。

2.4.3 心肌组织丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)的检测 取缺血区心肌组织200mg，在冰浴下制备10%心肌组织匀浆。用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量。用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。

2.5 统计学处理方法

3 结果

3.1 各组大鼠心肌细胞的凋亡情况

表1显示，模型组与假手术组相比，细胞凋亡率明显增加(P<0.01)，SSTF组细胞凋亡率均明显低于模型组(P<0.05，0.01)，提示SSTF可抑制缺血再灌注大鼠心肌细胞的凋亡。

表1 各组大鼠心肌细胞的凋亡情况(n=8，±s)

表1 各组大鼠心肌细胞的凋亡情况(n=8，±s)

注:与假手术组比较:*P<0.01;与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01

组别 给药剂量(mg/kg/d)细胞凋亡率%假 手 术 组 —1.48±0.7模 型 组 — 16.34±2.08*SSTF Ⅰ 组 17.5 14.27±1.96△SSTF Ⅱ 组 35.0 12.18±1.81△△SSTF Ⅲ 组 70.0 9.85±1.43△△

3.2 各组大鼠心肌组织SOD活性、MDA含量及血清LDH活性的变化

表2显示，与假手术组比较，IR组心肌组织中SOD活性显著降低(P<0.01)，MDA含量明显升高(P<0.01)，血清LDH活性显著升高(P<0.01);同缺血再灌注组比较，SSTF各组心肌组织中SOD活性升高(P<0.05，0.01)，MDA含量降低(P<0.05，0.01)，血清LDH活性明显降低(P<0.01)。

表2 各组大鼠心肌组织SOD活性、MDA含量及血清LDH活性的变化(±s，n=8)

表2 各组大鼠心肌组织SOD活性、MDA含量及血清LDH活性的变化(±s，n=8)

注:与假手术组比较:*P<0.01;与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01

组别 SOD(nmol/g/L)MDA(nmol/ml)LDH(U/L)256.1±71.83 3.25±0.84 578±21.26模 型 组102.29±51.84* 6.87±1.68* 947±64.45*SSTF Ⅰ 组 186.45±54.68△ 5.20±1.16△ 886±52.13△SSTF Ⅱ 组 218.32±57.76△△ 4.76±0.98△△ 683±40.28△△SSTF Ⅲ 组 224.56±61.65△△ 4.28±0.91△△ 632±36.09假手术组△△

4 讨论

近年的研究表明，脂质过氧化作用及能量代谢异常是导致心肌缺血及再灌注损伤的2个重要因素。心肌缺血时，由于心肌内源性氧自由基清除剂减少，氧自由基大量堆积;再灌注后，分子氧重新进入心肌组织中，氧自由基水平进一步上升，作用于心肌细胞膜，使膜磷脂结构中不饱和脂肪酸过氧化，导致细胞膜机械性损伤。心肌线粒体破溃、细胞肿胀、功能障碍甚至死亡。心肌缺血再灌注损伤后超氧化物歧化酶(SOD)活性下降，使氧自由基增多，从而氧自由基氧化不饱和脂肪酸释放的降解产物丙二醛(MDA)含量升高，丙二醛可引起大分子物质如蛋白质、脂类等相互交联、聚合，从而破坏了细胞膜的结构和功能;使胞浆酶(如肌酸激酶及其同工酶，乳酸脱氢酶等)释放增加，加速了心肌细胞损害程度，从而导致细胞凋亡的发生。本实验观察到，心肌缺血再灌注损伤时自由基清除剂SOD的活性明显降低，自由基脂质过氧化产物MDA含量明显升高，表明MIRI时存在明显的自由基代谢紊乱。经SSTF治疗后，SSTF干预组SOD活性明显升高，LDH活性明显下降，MDA浓度明显下降，表明SSTF具有较强的抗氧化作用，能增强缺血心肌的抗氧化能力，抑制心肌缺血再灌注后心肌细胞的凋亡，减轻和保护MIRI所致的心肌损伤。其作用机制可能是在细胞脂质过氧化过程中，一方面减少自由基的产生，加速ORF的清除，另一方面通过激活细胞内抗氧化酶SOD的活性，抑制ORF，降低脂质过氧化物，从而发挥抗脂质过氧化的作用。