当归拈痛汤及其拆方对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织VEGF表达的影响*

廖江铨，田佳星，陈俊绵，王 浩，袁立霞

(南方医科大学中医药学院，广东广州 510515)

类风湿性关节炎(Rheumatoidarthritis，RA)是一种病因未明、以关节炎症为主的慢性反复发作的全身性疾病。血管内皮生长因子又称为血管通透因子(vascular permeabiityfac tor，VEGF)，是一种细胞来源广泛的多功能性糖蛋白，它具有强大的促血管增生和增强血管通透性的功能。VEGF在RA的滑膜血管翳的形成过程中起关键作用，是联系各种炎性因子的枢纽，直接促进滑膜组织新生血管形成，并增强血管的通透性。当归拈痛汤是临床治疗RA行之有效的方剂，笔者采用弗氏完全佐剂诱导大鼠关节炎模型，观察当归拈痛汤及拆方对佐剂性关节炎大鼠滑膜组织VEGF蛋白表达的影响，探讨当归拈痛汤部分作用机制，为寻找新的临床用药提供实验依据。

1 材料

1.1 药物

当归拈痛汤:羌活、茵陈、炙甘草各15g，猪苓、泽泻、防风、知母、苍术、当归各9g，葛根、苦参、人参各6g，升麻、黄芩、白术各3g。

拆方1组(蠲痹组):羌活、茵陈各15g，猪苓、泽泻、防风、知母、苍术各9g，葛根、苦参各6g，升麻、黄芩各3g。拆方2组(扶正组):白术3g，人参6g，当归9g，炙甘草15g。

1.2 试剂

弗氏完全佐剂为Sigma公司产品;雷公藤多甙片为上海医科大学红旗制药厂生产，国药准字z31020415;VEGF免疫组化试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司生产。

1.3 动物

健康Wistar雄性大鼠60只，体重180g±20g，由南方医科大学实验动物中心提供，分笼饲养，室温18℃ ±2℃，相对湿度45% ～50%，空气新鲜，通风良好，自由摄食、饮水。

2 方法

2.1 大鼠佐剂性关节炎(AA)的模型制备

临用前从冰箱取出弗氏完全佐剂(CFA)，充分振荡、混匀。大鼠常规消毒后将其右后肢拉直，用1ml注射器针头于足跖中部皮内注射，每只大鼠注射0.1ml CFA。

2.2 分组方法

将Wistar雄性大鼠60只按体重大小随机分为6组，每组10只，设为空白对照组、模型组、雷公藤组、当归拈痛汤组、拆方1组、拆方2组。空白对照组不做任何处理。模型组、雷公藤组、当归拈痛汤组、拆方1组、拆方2组大鼠按 0.1ml/只给予弗氏完全佐剂注射于大鼠右后足垫内。

2.3 给药方法

实验第8天每天早8∶00灌胃给药，每日1次，全方组每日灌服当归拈痛汤11.34g/kg，拆方1组每日灌服8.37g/kg，拆方2组每日灌服2.97g/kg，阳性药对照组给予雷公藤多甙片混悬液9.45mg/kg灌服，空白组、模型组以1ml/100g蒸馏水给大鼠灌胃。连续灌胃给药21d，于末次给药2h后对大鼠进行相应处理。

2.4 滑膜组织血管内皮生长因子蛋白表达检测

滑膜取材方法:大鼠处死后，将大鼠仰位固定，酒精消毒，无菌处理，沿膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出以膝关节为中心约3×3cm2的区域，以齿镊提起髌骨。沿髌骨上沿约0.3×0.4cm2处向下切割直至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，此时即打开了膝关节腔，可见由髌骨下极向上延续有1层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织。完整剥离滑膜组织，用刀片完整切下。将大鼠滑膜组织，放入4%多聚甲醛(内含1/1000DEPC水)中固定2h，将已固定的标本取出，经梯度酒精脱水，即70%A→80%A→95%A→100%A×3逐级脱水，二甲苯透明，然后石蜡包埋供VEGF免疫组化。免疫组化方法(S-P法)具体步骤按试剂盒操作。

2.5 统计学处理

3 结果

应用免疫组化技术检测VEGF在AA大鼠滑膜组织中蛋白的表达，并观察了当归拈痛汤及其各拆方组对其的影响，其结果如下。

表1 各组AA大鼠滑膜VEGF表达的比较(s)

表1 各组AA大鼠滑膜VEGF表达的比较(s)

注:与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01;与全方组比较:*P<0.05

组别 例数(n)VEGF(%)空 白 组 10 8.79±1.33△△模 型 组 9 15.24±4.25雷 公 藤 组 9 10.98±2.80△△全 方 组 10 9.34±2.08△△拆 方 1 组 10 11.56±2.81△*拆 方 2 组 10 12.18±2.97△*

结果显示，空白组大鼠滑膜组织血管周围中仅见少量的VEGF阳性细胞，模型组大鼠滑膜血管周围可见大量VEGF阳性细胞，滑膜组织中VEGF阳性表达较空白组有显著增多，2组相比差异显著(P<0.01);当归拈痛汤、雷公藤组可见少量的VEGF阳性细胞，与模型组比较有显著性差异(P<0.01);两拆方组滑膜组织VEGF阳性细胞呈现中量的阳性表达，与模型组有显著性差异(P<0.05)，与全方组比较有显著性差异(P<0.05)，二者比较无差异。说明当归拈痛汤全方组、雷公藤组、拆方1组、拆方2组均能降低优于滑膜组织中VEGF的表达，其中全方组作用最强，两拆方组疗效相当，具有协同作用，配伍应用后疗效明显提高。

4 讨论

VEGF与RA形成机制的研究最早是Fava在1994年提出的，Fava将RA的滑膜组织进行切片和VEGF免疫组化染色后发现，在滑膜的衬里层细胞中检测到数目较多的VEGF阳性细胞，与其对照的骨关节炎(OA)组滑膜全部为阴性结果，推断VEGF是RA关节滑膜病变有别于OA的一个重要特征，在RA滑膜血管新生中起关键作用。近期研究证明，RA关节炎发病早期滑膜有较高水平的VEGF表达，VEGF的表达水平与AA大鼠关节炎指数积分具有明显的相关性。因此，VEGF可能是RA早期发病过程中的一个重要信号分子，它通过促进血管增生，增加血管通透性，加速滑膜血管翳的生成;另外，它可能与其他炎症细胞因子形成复杂的信号网络，共同促进慢性炎症的形成和发展。

本实验研究表明，造模后AA模型大鼠组织病理形态学观察到AA模型大鼠滑膜组织表现为滑膜增厚、血管增生和血管翳形成。免疫组化显示，VEGF表达亦明显增高，呈强阳性表达，提示RA早期就有新生血管的形成，VEGF表达与血管生成密切相关。进一步研究证实，VEGF参与了RA滑膜组织血管翳形成和发展过程。通过当归拈痛汤全方组、拆方1组、拆方2组、雷公藤组药物进行干预后，各组大鼠VEGF的表达量与模型组大鼠比较有不同程度减少，提示当归拈痛汤组、拆方1组、拆方2组、雷公藤组均具有下调VEGF表达的作用。其中当归拈痛汤全方组、雷公藤组疗效最佳，两拆方组疗效相当。为此，推测当归拈痛汤治疗RA的机制可能是通过以下途径实现的:①本方选用羌活、茵陈、黄芩、苍术、白术、人参等蠲痹扶正中药具有调节免疫、阻断炎性细胞因子、阻断关节炎的继续发展;②RA滑膜血管翳是一种缺氧的高代谢组织，当归拈痛汤中的当归可活血化瘀，加速局部的血液循环，提高局部组织的氧供，抑制缺氧刺激的VEGF上调，降低关节炎的发展，防止血管翳形成和骨质破坏。综上所述，VEGF参与了RA病理的形成和发展，而当归拈痛汤可能通过抑制VEGF表达而阻断滑膜炎症、血管新生和血管翳形成。