黄连解毒汤对幼龄自发性高血压大鼠内皮功能影响研究*

岳桂华，张志伟，孟子誉

(广西中医学院附属瑞康医院，广西南宁 530011)

原发性高血压(essential hypertension，EH)是临床常见的心血管疾病之一。既往研究发现，在高血压阶段时存在血管内皮细胞功能障碍[1]，内皮功能障碍甚至成为高血压病人不良结局的预测因子，但其与高血压发病的因果关系却尚未明了。高血压和内皮功能障碍具有相似的病因和发病机制，目前多数认为高血压是内皮功能障碍的病因，但也有研究发现，内皮功能紊乱可出现在血压增高以前一段时期前[2]。SHR是国际公认的最接近于人类原发性高血压的动物模型，研究幼龄SHR可以更好地了解内皮功能情况。因此，我们以幼龄SHR为研究对象，并以黄连解毒汤为施加因素，观察幼龄SHR内皮功能变化，探讨黄连解毒汤防治高血压的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

雄性6周自发性高血压大鼠(SHR)16只和同类6周正常血压wistar-kyoto(WKY)8只，体重80g～130g，SHR购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2006～0009)。WKY组为空白对照，购自广西医科大学动物实验中心(合格证号SCXK(桂)2006-0003)，SHR随机分为黄连解毒汤组、模型组每组8只。动物正常光照，食水自由摄取，室温控制在18℃ ～22℃之间。

1.2 方法

1.2.1 药物干预 黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏、栀子按3∶2∶2∶3比例组成，其药材均购于广西中医学院附属瑞康医院药剂科，专人负责质量标准，煎煮取汁，浓缩成清膏(1g清膏相当于1.5g黄连解毒汤生药)。蒸馏水稀释1倍后，HLJD组按10ml/kg/d灌胃，模型组和正常对照组按10ml/kg/d灌服蒸馏水。药物充分用蒸馏水混匀，于每日上午9时灌胃给药，SHR对照组及WKY正常对照组每日同时用等容积蒸馏水灌胃，每日1次，连续给药6周。

1.2.2 试剂及仪器 ET-1和vWF试剂盒由武汉中美科技有限公司生产;SOD、MDA试剂盒由南京建成生物工程研究所生产;BP-6大鼠无创血压测试仪由成都泰盟科技有限公司生产;MK3酶标仪由美国Thermo生产;1575洗板机由美国BIO-RAD生产。

1.2.3 血压测量 分别于给药前及给药后1、2、4、6周，测量大鼠安静清醒状态下尾动脉收缩压(SBP)。每只鼠连续测量SBP 3次，间隔60s，取其平均值为当次所测得血压值。

1.2.4 样品采集与测定 大鼠给药6周后，用2%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉，腹主动脉取血6ml，按3000r/min 离心10 min，用于 NO、ET-1、vWF、SOD和MDA水平的检测。标本均置于－20℃冰箱保存待测。ET-1、vWF测定采用酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)。ET-1产品编号为E0482r，vWF产品编号为E0833r，操作步骤均严格按试剂盒说明书进行。硝酸还原法测定血浆NO的含量，黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统检测SOD，硫代巴比妥酸比色法检测MDA。其中血浆NO采用硝酸还原酶法，通过显色深浅测定其浓度的高低;SOD测定通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度仪测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对幼龄大鼠血压的影响

正常情况下6周幼龄大鼠的血压仍然处于自发性初始升高的阶段。表1显示，与空白对照组比较，治疗前各组SHR大鼠没有统计学差异(P>0.05)，模型对照组随着鼠龄的增长呈现血压进行性增高，在实验开始第2周时表现出的血压升高P<0.05，第6周时的血压升高P<0.01。而黄连解毒汤组能降低大鼠进行性血压增高的趋势，治疗6周后血压前后变化没有统计学意义(P>0.05)。与同时间段模型组比较，在给药第4周后对SHR产生了显著的降压作用(P<0.05);与空白对照组比较，给药第4周后，黄连解毒组的血压水平与空白对照组水平相当(P>0.05)。

2.2 对幼龄 SHR 血浆 NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的影响

表2显示，与空白组比较，模型组幼龄SHR血浆中 vWF、MDA 升高(P<0.05或 P<0.01)，NO、SOD降低(P<0.05)，ET-1无明显变化，表明SHR在高血压前期已存在内皮功能不全。与模型组比较，黄连解毒能够显著降低血浆vWF、MDA(P<0.05)，升高 NO、SOD(P<0.05)。

表1 治疗前后各组大鼠血压的变化(s，mmHg，n=8)

表1 治疗前后各组大鼠血压的变化(s，mmHg，n=8)

注:与同时间段空白对照组比较:#P<0.05，##P<0.01;与同时间段模型组比较:＆P<0.05，＆＆P<0.01

组 别 0周 1周 2周 4周 6周空白对照组 119.68±2.04 115.96±2.86 114.81±3.37 114.36±3.00 115.02±2.08模型对照组 121.78±5.51 122.47±8.32 124.66±9.31# 130.02±13.18# 136.64±2.72##黄连解毒组 123.84±8.84 124.04±9.63 125.00±8.79# 116.25±5.06＆ 116.56±3.08＆

表2 治疗前后各组大鼠血浆NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的变化(s)

表2 治疗前后各组大鼠血浆NO、ET-1、vWF、SOD、MDA的变化(s)

注:与空白对照组比较:#P<0.05，##P<0.01;与模型对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

组 别 动物数 NO(μmol/L)ET-1(pg/ml)vWF(ng/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)空白对照组 8 31.141±6.964 73.732±16.262 2740.514±939.512 132.809±14.692 2.990±0.453模型对照组 7 20.795±7.037# 86.979±11.941 6940.451±843.673## 114.652±15.261# 4.170±0.408#黄连解毒组 8 33.807±9.771* 78.307±19.495 5571.707±1322.095##*137.920±16.033* 3.512±0.995*

3 讨论

自发性高血压大鼠(SHR)是1963年Okamoto用Wistar大鼠培育而成的，其被毛呈白色，无明显原发性肾脏或肾上腺损伤，心血管疾病发生率高。SHR从发病机制、高血压心血管并发症、外周血管阻力变化、对盐的敏感性等多方面来讲，都与人类高血压患者相似，是目前国际公认的最接近于人类原发性高血压的动物模型，是基础研究及药物筛选的首选。该种大鼠出生后3～4周血压开始升高，12～24周时达到高峰，因此出生后4～12周是血压持续升高的重要阶段。

黄连解毒汤首载于葛洪《肘后备急方》，但未给出方名，王焘《外台秘要》始冠以黄连解毒汤之名。本方由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味中药按比例配伍组成，其中以黄连泻心火、兼泻中焦之火为君;黄芩清肺热、泻上焦之火为臣;黄柏泻下焦之火，栀子通泻三焦之火，导热下行，合为佐使，共收泻火解毒之功。黄连解毒汤及其配伍成分在心血管疾病的防治中起着越来越重要的作用，在临床上已用于高血压等心血管疾病的治疗。我们观察表明，6周龄的SHR血压与WKY有增高的趋势，但无明显差异(P>0.05);8周龄模型组增高明显，12周龄后非常明显。研究表明，与模型组比较黄连解毒汤组能降低SHR的血压(P<0.05)，表明该方能在幼龄SHR控制高血压的上升。

一般认为，高血压病和内皮细胞功能障碍之间有密不可分的关系，高血压是内皮损伤的始动因素之一[3]。内皮损伤程度可以反映高血压患者病情严重程度，且内皮功能障碍有遗传倾向[4]。原发性高血压患者内皮功能减退，NO生成减少或生物利用度降低，可能与氧化应激有关。其机制是高血压内皮损伤后，NOS作用底物L2精氨酸缺乏，NOS活性受限、表达异常或其辅助因子异常，自由基生成增多，超氧化物歧化酶(SOD)缺乏致超氧阴离子生成，NO生成减少和活性被破坏，且生物利用度降低，导致内皮依赖性舒血管作用下降。研究表明[5～7]，正常情况下，机体各组织包括血浆均含有一定活性的抗氧化酶系，可及时有效地清除氧自由基。SOD是其中最重要的抗氧化剂，是人体内天然的抗氧化酶，通过催化超氧阴离子自由基的自身氧化还原反应，有效清除自由基，维持体内自由基的动态平衡，以避免损伤机体的组织细胞。应用外源性SOD和过氧化氢酶，可以保护内皮细胞功，松弛血管平滑肌。NO是一种血管内皮舒张因子，具有松弛平滑肌、舒张血管的作用。血管内皮细胞可以合成NO，后者弥散入血管平滑肌细胞，活化鸟苷酸环化酶，使GTP转化为cGMP，后者促进Ca2+内流，引起平滑肌松弛，血管扩张和血压下降。高血压病患者SOD水平较对照组显著下降，MDA的增加也印证了SOD的下降，提示高血压病患者存在氧化反应增强及抗氧化能力降低，体内活性氧增加，引起并加重内皮功能失调。

对有原发性高血压家族史血压正常子代的研究发现，其基础NO分泌减少，除提示内皮功能障碍有遗传倾向外，同时也说明NO分泌减少，内皮依赖性的舒张功能受损也是导致高血压的危险因素[8]。也有研究表明，有高血压家族史的正常子代体内的ET-1水平并不增高，而NO水平却显著性增高，并且有NO水平增高的子代易患高血压，提示可能这些人的机体内存在NO抵抗。NO和ET-1的分泌失衡是导致高血压的重要影响因素。内皮细胞损伤后，内皮细胞释放的很多活性物质如凝血酶、ADP、ATP、5羟色胺等舒血管作用变为缩血管作用，从而影响ET-1、NO的协调状态，破坏了自身调节体系的平衡，使得ET合成增多，影响NO的合成和释放，导致血管张力调节的紊乱，内皮依赖性舒张功能下降，收缩功能增强，血管壁结构发生变化，导致血压的升高。而主要是NO生成不足或活性降低，致使内皮功能障碍，引起高血压的发生。同时研究表明，vWF是内皮细胞损伤及功能不全的标记物之一，血浆vWF升高表明存在内皮功能障碍。

我们研究表明，模型组SHR血浆中NO、SOD降低，vWF、MDA上升，较空白对照有明显差异(P<0.05)，ET-1有上升的趋势，但无统计意义(P>0.05)，表明SHR在血压达到高峰前已存在内皮功能不全。提前应用黄连解毒汤能保护受损的内皮功能，这也体现了中医的“治未病”思想和理念。但黄连解毒汤预防高血压的确切机制还有待进一步的研究。

[1]Tanner FC，Boulanger CM，Luscher TF.Endothelium-derived nitric oxide，endothelin，and platelat vessel wall interaction:alteration in hypercholesterolemia and atherosclerosis.Seminars in thrombosis and hemastasis.1993，19:167-75.

[2]陈明，胡申江，张健，等.不同危险度的高血压人血管内皮功能.高血压杂志2006，14(4):257-260.

[3]Spencer CG，Martin SC，Felmeden DC，et al.Relationship of homocysteine to markers of platelet and endothelial activation in“high risk”hypertensive:a substudy of the Anglo2Scandinavian Cardiac Outcomes Trial[J].Int J Cardiol，2004，94(223):293-300.

[4]Li Lijun， Yu chengman， Geng Shuren， et al.Endothelial dysfunction in young normotensive subjects with a family history of essential hypertension[J].Xi′an MED UNIV，2002，14(1):81-85.

[5]George S，Chaturvedi P.Protective role of ocimum canum plant extract in alcohol-induced oxidative stress in albino rats[J].Br J Biomed Sc，2008，65(2):80-85.

[6]El-Nab，i KamelMA，ShehataM.Effect of toluene exposure on the antioxidant status and apoptotic pathway in organs of the rat[J].Br J Biomed Sc，2008，65(2):75-79.

[7]Hirsch AT. Vasculardisease， hypertension and prevention:“fromendothelium to clinical events”[J].JACC，2003，42:377-379.

[8]McAllister AS，Atkinson AB，Johnston GD，et al.Basal nitric oxide production is impaired in offspring of patients with essential hypertension[J].Clin Sci(Lond)，1999，97(2):141-147.