胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移作用的实验研究

李传友 高宜录

河南省新乡市中心医院神经外科（453000）

自从神经干细胞成功分离，为中枢神经系统疾病治疗上存在的诸多问题的解决提供了可行办法。但是，如何使移植神经干细胞准确有效的迁入其所需部位并分化是近年神经科学工作者所关注的一个热点。本实验通过研究胶质瘤细胞在体外对神经干细胞的迁移诱导作用，为将来神经干细胞的临床应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠由南通医学院实验动物中心提供，C6细胞株购自中科院上海细胞所，5-BrdU购自NEOMARKERS公司，Mouse Anti-Nestin IgG1购自CHEMICON公司，Mouse Anti-BrdU IgG1为NEOMARKERS公司产品。

1.2 方法

1.2.1 神经干细胞培养及传代

选用1～2d的SD大鼠，碘伏消毒后，在超净台下解剖暴露两侧大脑半球及小脑，取少许两侧大脑皮层组织，大小约1mm3，放入DMEM/F12培养基洗涤两遍，尽量将组织剪碎；将皮层组织转移至10mL玻璃离心管并加入6～8mL DMEM/F12培养液，用毛细吸管将皮层组织机械分离成单细胞悬液，筛网过滤，离心（500r/min）5min，弃上清液并用bFGF2、B27、D MEM/F12培养基定容，细胞记数。按25cm2培养瓶中接种1×106个/4mL进行接种。将培养瓶放入37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，5～7d原代神经细胞球形成。3～4d更换培养液。

将原代神经球吹打制成单细胞悬液，接种至含Brdu（浓度为5μmol/L）的bFGF2、B27、DMEM/F12培养液中培养5～7d即可形成次代神经球。换液同前。

1.2.2 Nestin和 Brdu免疫荧光检测

Nestin免疫荧光检测：①贴壁：将培养的原代神经细胞球吸出，接种至置于24孔培养板内的盖玻片（多聚赖氨酸包被），放入37℃、5%CO2培养箱培养2h，使神经细胞球贴壁。②固定：吸去培养液加入4%多聚甲醛少许，室温下固定30min，去除固定液，PBS洗涤3次，每次10min。③封闭：用含10%羊血清、0.3% Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃条件下孵育封闭10min。④检测：加一抗（小鼠抗Nestin IgG1按1∶500倍稀释），放入4℃冰箱过夜，吸去一抗，洗涤同前。再加入二抗（FITC标记的羊抗小鼠IgG，按1∶150倍稀释），避光，在37℃水浴箱内孵育30min，吸去二抗，洗涤同前。⑤观察记录：在激发光波长为490nm，滤色光波长为520nm的共聚焦显微镜下观察照相（图1）。

Brdu免疫荧光检测：①贴壁；②固定；③封闭。方法同Nestin检测。④检测：一抗为小鼠抗Brdu IgG1 （按1∶1000倍稀释），二抗为FITC标记的羊抗小鼠IgG（按1∶200倍稀释），余操作同前。⑤观察记录（图2）。

1.2.3 胶质瘤细胞与神经干细胞联合培养

将C6胶质瘤细胞、神经干细胞分别接种在置于6孔培养板内的半圆盖玻片上（多聚赖氨酸已包被），用无血清培养基培养2～4h使细胞贴壁，将胶质瘤细胞所贴壁的盖玻片与神经干细胞贴壁的盖玻片一起放在24孔培养板培养，并设空白对照，观察神经干细胞的生长及其形态学变化（图3）。

2 结 果

2.1 Nestin和 Brdu免疫荧光检测

Nestin即巢蛋白，是一种仅存于神经上皮干细胞的中间丝成分，可作为神经干细胞的标志物。我们通过免疫荧光检测，发现神经球内的几乎所有细胞均呈Nestin阳性。从而证明我们培养的细胞球是神经干细胞球。

5-BrdU免疫荧光检测：5-BrdU即5-溴-2脱氧尿苷，它是胸腺嘧啶核苷的替代品。在细胞分裂的DNA合成前期，可以作为底物结合到新合成的DNA中，从而可验证神经干细胞的增殖能力。我们将用含5-BrdU的培养液培养形成的次代神经细胞球进行抗-BrdU免疫荧光检测显示，绝大多数细胞呈BrdU阳性。

图2 神经干细胞传代能力鉴定

图3 神经干细胞和C6细胞联合培养（20×）

2.2 C6细胞与神经干细胞联合培养

C6细胞和神经干细胞联合培养，可观察到神经干细胞分化，长出细胞突起，神经细胞球周围的细胞突起的密度及长度在各个方向上有明显的差异，在靠近胶质瘤细胞的一侧，突起的密度及长度均大于在其他方向上的突起，并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向移动了。

3 讨 论

3.1 神经干细胞培养及鉴定

自1992年Reynolds等[1]首先报道自成年小鼠纹状体分离培养出能在体外不断增殖，具有多种分化潜能的神经干细胞以来，对神经干细胞的研究便成为热点。后来的研究又在海马齿状回、脊髓、隔区、纹状体的实质及人的大脑内均成功分离出神经干细胞[2-4]。近年，分离、培养干细胞的技术日臻成熟。从实验用神经干细胞获取的角度看，从胎脑的纹状体区和海马齿状回容易获得，但对动物和取材技术要求较高。用成熟大鼠取材对培养技术和培养基要求又较高，不易存活。我们从新生大鼠大脑皮层分离培养出了具有分裂增殖能力的神经干细胞，在体外培养条件下形成典型的神经细胞球。Nestin免疫荧光染色为Nestin阳性，并通过5-BrdU免疫荧光染色证实这些细胞具有分裂增殖能力。说明新生大鼠皮层可培养出神经干细胞。我们的体会是从新生大鼠皮层分离培养神经干细胞有实验动物容易获得、取材简单、一次可获得大量干细胞和干细胞易成活的优点。

3.2 胶质瘤细胞和神经干细胞共培养

Qu等[5]将神经干细胞注入2岁大鼠的侧脑室，发现神经干细胞在鼠脑内出现对称性迁移并分化成神经元和胶质细胞；Corbin等[6,7]研究发现，神经元有两种不同的迁移方式，即放射状迁移和正切迁移。这些研究提示，在成年人脑内可能有特定的诱导神经干细胞迁移的机制和信号物质。Kim等[8]的研究初步证明了这一点，他们发现端脑的GABA类联络神经元和小脑的谷氨酸类神经元分泌至细胞外基质的一种名为Reelin的糖蛋白，在神经干细胞的迁移中起重要作用。更有趣的是，Karen等[9]发现将神经干细胞移植至有移植胶质瘤生长的鼠脑内，神经干细胞很快充满肿瘤，并沿着浸润的肿瘤细胞而分布，即使将神经干细胞接种在肿瘤的远隔部位，甚至把神经干细胞接种在对侧大脑半球和侧脑室，它们也可穿过正常脑组织移行入胶质瘤。这说明胶质瘤的生长环境中或胶质瘤细胞本身存在着引导神经干细胞迁移的信号物质。假设胶质瘤细胞产生这种信号物质，那么在体外培养的胶质瘤细胞也应该有这种作用，如果我们能证实这种作用，即说明胶质瘤细胞中存在引导神经干细胞迁移的物质。于是，我们首先设计了限定区域共培养的方法在体外培养条件下观察神经干细胞的生长及其形态学变化。在实验中，我们从形态学方面观察到与胶质瘤细胞共培养的神经干细胞出现迁移和分化现象，具体作用机制还有待进一步研究。但该研究已初步说明在体外培养条件下胶质瘤细胞具有诱导神经干细胞迁移作用。从而为进一步研究胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移的机制，并为神经干细胞应用于临床，提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的治疗效果奠定了一定的基础。

[1]Reynolds BA,Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J].Science,1992,255(5052):1707-1709.

[2]Temple S,Alvarez-Buylla A.Stem cells in the adult mammalian central nervous system[J].Curr Opin Neurobiol,1999,9(1):135-141.

[3]Doetsch F,Alvarez-Buylla A.Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(25):14895-14900.

[4]Eriksson PS,Perfilieva E,Bjork-Eriksson T,et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus[J].Nat Med,1998,4(11):1313-1317.

[5]Qu T,Brannen CL,Kim HM,et al. Human neural stem cells improve cognitive function of aged brain[J]. Neuro Report,2001,12(6):1127-1132.

[6]Corbin JG,Nery S,Fishell G. Telencephalic cells take a tangent: nonradial migration in the mammalian forebrain[J]. Nat Neurosci,2001,4(Suppl):1177-1182.

[7]Marin O,Rubensiein JL. A long,remarkable journey: tangential migration in the telencephalon[J]. Nat Rev Neurosci,2001,2(11):780-790.

[8]Kim HM,Qu T,Kriho V,et al. Reelin function in neural stem cell biology[J]. Neurobiology,2002,99(6):4020-4025.

[9]Karen S, Aboody,Alice Brown, et al. Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: Evidence from intracranial gliomas [J]. Proc Natl Acad Sci USA,2001,97(23):12846-12851.