黄鳍金枪鱼头蛋白酶解液及分级组分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

杨 萍,蔡本利,洪鹏志

水产品深加工广东普通高校重点实验室广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088

金枪鱼是远洋渔业的重要经济鱼类,作为一种深海鱼类,金枪鱼肉质鲜美,营养全面,是现代人喜爱的美食。研究表明,金枪鱼保健功能显著,具有防止动脉硬化,保护肝脏、治疗贫血多方面的功效[1],其加工产品附加值非常高。目前,金枪鱼除少部分冰鲜销售外,一般都经冷冻制成冷冻金枪鱼肉,通常都用来制成鱼生、寿司、调味或罐装食品。金枪鱼加工过程中会出现大量的下脚料,包括鱼头、内脏、鳃、鱼皮等,产生的下脚料大约占总重量的 50% ～70%,下脚料中含有大量的蛋白质,脂肪、矿物质及多种生物活性物质,是值得开发利用的资源。海洋生物是研究开发功能性活性物质的良好资源。目前,海洋生物中免疫活性物质的研究主要集中在贝类,有牡蛎提取物[2]、扇贝多肽[3]、文蛤提取物[4]、鲍鱼酶解提取物[5]等,海洋鱼类来源的免疫活性物质的研究少见有报道。我们对金枪鱼属中产量最大的黄鳍金枪鱼(Thunnus albacares)鱼头的营养成分[6]进行了研究,报道了其蛋白酶解液对小鼠免疫功能的调节作用[7],本文报道黄鳍金枪鱼头蛋白酶解液及其超滤组分对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响,旨在探讨金枪鱼头蛋白酶解物的免疫调节活性,为进一步的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF级 Balb/c种小鼠(合格证编号:0016240),雄性,19～21 g,购自广东省医学实验动物中心;黄鳍金枪鱼头,由广东省广远远洋渔业集团有限公司提供(冰柜中冷冻保存);木瓜蛋白酶、中性蛋白酶,购自广西南宁庞博生物有限公司;RPMI1640培养液,购自北京天润善达生物科技有限公司;青霉素/链霉素(10000 IU/mL),购自中国医学科学院生物医学工程研究所;新生牛血清,购自杭州四季清生物技术公司产品;MTT,Duchefa产品;刀豆蛋白 A(ConA),Calbiochem产品;二甲基亚砜 (DMSO)、脂多糖(LPS)购自 sigma公司;杯式超滤器购自上海亚东核级树脂有限公司,酶标仪为 Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 黄鳍金枪鱼头蛋白酶解液及分级组分的制备

金枪鱼头热水浸提后取肉,绞碎,匀浆,按文献[8]条件进行酶解,100℃水浴灭酶 10min,冷却后,以 4000 r/m in离心 10 min,弃去上层油脂、杂质和下层沉淀,中间清液即为金枪鱼头蛋白酶解液EPTH(以下简称酶解液),酶解液在 0.25 MP压力下,先后经过截留分子质量为 10、5、3、1 kD的平板膜进行超滤,得到分子量为 10 kD以上、10～5 kD、5～3 kD、3～1 kD、1 kD以下五级组分,将五级组分的蛋白质含量调整与酶解液的浓度一致,于 121℃高温灭菌后,分别标记为组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ,冷藏备用。

1.2.2 淋巴细胞的制备

拉颈处死 Balb/c小鼠,无菌取脾,剪碎研磨后,于 200目筛网上 Hank's冲洗过滤,制成细胞悬液。无菌条件下 1000 r/min离心 5m in,弃上清,加入 2 m L红细胞裂解液,静止 5 min裂解红细胞,1000 r/min离心 5min,弃上清。Hank's液冲洗脾细胞,离心后弃上清,重复 1次,2 mLRPMI1640完全培养液重悬脾细胞,台盼兰染色计数,调整其浓度为 4×109/L,活细胞数 ＞95%。

1.2.3 淋巴细胞增殖反应[9]

无菌条件下,向 96孔板中依次加入上述脾细胞悬液 100μL,各组对照孔加完全培养液 4μL,试验孔加受试样品 4μL;ConA处理组加 ConA(100mg/L)10μL/孔,LPS处理组加 LPS(200 g/L)10μL/孔,用完全培养液补足每孔体积为 200μL,脾细胞终浓度为 2×109/L。每个处理设 6个复孔,置于 37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养 48 h,培养结束前 4 h,每孔加无菌 MTT(5 g/L)溶液 25μL,振荡均匀。培养结束后,4000 r/m in离心 5 min,弃上清,每孔加 200μL DMSO终止反应,振荡均匀,显色 10 min,用酶标仪在 570 nm波长下测各孔的吸光值(A值),以刺激指数(SI=试验孔 A值 /对照孔 A值)判断淋巴细胞转化程度。

1.2.4 EPTH及分级组分的氮含量的测定

氮含量:半微量凯氏定氮法[10],蛋白质含量 =总氮 ×6.25

1.3 数据统计与处理

所得数据用 Spss13.0软件处理,结果以 ±s表示,用 LSD检验进行显著性分析。

2 结果

2.1 EPTH及分级组分对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响

2.1.1 无有丝分裂原刺激条件下,EPTH及分级组分对小鼠淋巴细胞增殖的影响

由表 1可见,在无有丝分裂原刺激条件下,与对照组相比,组分Ⅵ(酶解液)对小鼠脾淋巴细胞增殖没有显著的促进或抑制作用,组分Ⅱ和组分Ⅴ能显著提高小鼠脾淋巴细胞的增殖活性,并且组分Ⅴ的SI达到 1.93,能非常显著促进淋巴细胞增殖,与组分Ⅱ相比,差异性极显著(P＜0.001),其余 3组分对小鼠淋巴细胞增殖有轻微的抑制作用,但无显著性。

2.1.2 Con A刺激条件下,EPTH及分级组分对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响

由表 1可见,与对照组相比,组分Ⅵ对由 Con A诱导的 T淋巴细胞增殖有轻微的抑制作用,但无显著性;组分Ⅱ和组分Ⅴ对由 ConA诱导的 T淋巴细胞增殖有极显著的促进作用,而且组分Ⅴ的促进作用更加显著,与组分Ⅱ相比,差异极其显著(P＜0.001)。其他组分对 Con A诱导的 T淋巴细胞增殖有轻微的抑制作用,但无显著性。

2.1.3 LPS刺激条件下,EPTH及分级组分对小鼠淋巴细胞增殖能力的影响

由表 1可见,与对照组相比,EPTH及分级组分的 SI均大于 1,说明均有一定的促进 LPS诱导的 B淋巴细胞增殖的活性,其中,组分Ⅱ和组分Ⅴ对 LPS诱导的 B淋巴细胞增殖有极显著的促进作用,而且组分Ⅴ的促进作用更加显著,与组分Ⅱ相比,差异极其显著(P＜0.001)。EPTH与其余 3组分均无显著性。

表 1 EPTH及分级组分对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响±s,n=6)Table 1 Effects of EPTH and its portions onmouse spleen lymphocyte proliferation±s,n=6)

表 1 EPTH及分级组分对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响±s,n=6)Table 1 Effects of EPTH and its portions onmouse spleen lymphocyte proliferation±s,n=6)

注:任意两组间,不含相同小写字母,a、b、c:P＜0.05;不含相同大写字母,A、B、C:P＜0.01;不含相同字母,E、F、M:P＜0.001。 Note:Between any two groups:a,b,c:P＜0.05;A,B,C:P＜0.01;E,F,M:P＜0.001.

组别Group ConA(-)LPS(-) ConA(+) LPS(+)对照 0.2574±0.0135cFM 0.2868±0.0333cCM 0.2743±0.0217BM组分Ⅰ 0.2433±0.0182cFM(SI=0.95) 0.2432±0.0154dDM(SI=0.85) 0.2990±0.0161BFM(SI=1.09)组分Ⅱ 0.2974±0.0556bF(SI=1.16) 0.3478±0.0189bBF(SI=1.21) 0.3456±0.0173AEF(SI=1.26)组分Ⅲ 0.2196±0.0131cM(SI=0.85) 0.2478±0.0150dCDM(SI=0.86) 0.2935±0.0297BM(SI=1.07)组分Ⅳ 0.2220±0.0188cM(SI=0.86) 0.2632±0.0190cdCDM(SI=0.92) 0.2770±0.0158BM(SI=1.01)组分Ⅴ 0.4962±0.0419aE(SI=1.93) 0.5050±0.0321aAE(SI=1.73) 0.3730±0.0093AE(SI=1.36)组分Ⅵ 0.2585±0.0161bcFM(SI=1.00) 0.2654±0.0162cdCDM(SI=0.93) 0.2853±0.0052BM(SI=1.04)

2.2 EPTH及分级组分的蛋白质含量

酶解液及分级组分的蛋白质含量结果如表 2所示,随着截留分子质量的降低,各分级组分的蛋白质含量降低;EPTH主要由 10KD以上(组分Ⅰ)和 10～5 kD(组分Ⅱ)的多肽组成,分别占 38.21%、38.9%,1 kD以下(组分Ⅴ)的小肽只占 5.39%。

表 2 EPTH及分级组分的蛋白质含量Table 2 Contentof protein of EPTH and its portions

3 结果与讨论

脾脏是周围淋巴器官,内有大量的 T、B淋巴细胞,是产生细胞和体液免疫应答的部位,有丝分裂原ConA和 LPS能分别激活 T、B细胞,促进 T、B细胞增殖,机体淋巴细胞在受到非特异性抗原刺激后,细胞增殖分化,发生免疫应答反应。淋巴细胞增殖能力的强弱可反映机体细胞免疫功能的强弱.我们的结果显示,组分Ⅱ(10～5 kD)和组分Ⅴ(1 kD以下)均是促进小鼠脾淋巴细胞增殖作用最显著的组分,不仅本身具有有丝分裂原活性,单独作用即能明显促进淋巴细胞增殖,而且还能与有丝分裂 LPS、ConA协同促进淋巴细胞增殖,从而提高机体免疫力的能力,组分Ⅴ比组分Ⅱ显示出更强的促进作用(P＜0.001);酶解液及其余 3组分对小鼠脾淋巴细胞的增殖均没有显著的促进或抑制作用。说明组分Ⅱ和组分Ⅴ富集了促进小鼠脾淋巴细胞增殖的因子。

膜分离方法用于蛋白及肽的分离在近年来取得了很大进展,Paule等[11]采用纳滤膜处理 β-乳球蛋白的胰蛋白酶水解产物来除去其中的肽聚集体,使需要的肽得到富集,膜分离操作在免疫活性大豆肽研究开发过程中具有应用价值[12]。黄鳍金枪鱼头蛋白经酶解所得酶解液并没有显著的促进或抑制小鼠脾淋巴细胞增殖作用,经超滤分离所得的组分Ⅱ和组分Ⅴ单独作用及与 LPS、ConA协同作用均能显著促进淋巴细胞增殖,可能是酶解显露了具有免疫促进作用的肽段,推测酶解液存在相互抗秸的因子,因而酶解液没有显示出促进或抑制小鼠脾淋巴细胞增殖作用,而超滤分离使组分Ⅱ和组分Ⅴ富集了促进小鼠脾淋巴细胞增殖的因子。本文结果为黄鳍金枪鱼头蛋白酶解液进一步开发利用研究提供了参考。

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