携带小鼠HVEM的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定*

马衣努尔·买提托合提 韩凌斐 廖术杰 周志刚 董 红 马 丁 王世宣

华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科,武汉 430030

疱疹病毒侵入介体(herpes virus entry mediator,HVEM)是1996年被Montgomery等[1]发现的一个肿瘤坏死因子受体超家族成员,主要表达在T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和中性粒细胞表面[2],同时HVEM也广泛表达在各内脏器官。目前发现 HVEM 有 5个配体,分别是 HSV.gD、LIGHT 、LT-α,BT LA 和 CD160[3-4]。HVEM 与不同的配体结合发挥不同的生物学作用,与单纯疱疹病毒包膜糖蛋白D(HSV.gD)结合介导HSV感染细胞过程[5];HVEM与其配体信号通路 LIGHT/LTα/HVEM 在T细胞活化提供共刺激信号、肿瘤免疫、移植免疫、炎症反应、自身免疫性疾病的发生等过程中发挥重要的作用[6]。HVEM分子中的一个位点可以和免疫球蛋白超家族成员B,T淋巴细胞弱化因子(BT LA)结合,而BT LA是一种抑制性的信号蛋白可以抑制T细胞活化[7]。另外,新近发现它可与另一配体 CD160结合而抑制 T细胞增殖[8],可能为自身免疫病的治疗提供新思路。因此在本研究中我们进行了重组rAAV-HVEM病毒颗粒的包装、纯化、滴度测定及感染真核细胞后HVEM的表达鉴定,为探讨其在各种疾病免疫调控系统中扮演的角色及其机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、菌株及腺相关病毒载体系统

E.coli DH-5α菌株为本室保存,质粒 pcDNA3.1购自TaKaRa Biotec公司,腺相关病毒载体系统购自Stratagene公司,包括腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP(含报告基因hrGFP)辅助质粒pAAV-Helper和包装质粒pAAV-RC。

1.2 实验动物和细胞株

C57B/6小鼠购自湖北省医学实验动物中心。病毒包装细胞AAV-293购自Stratagene公司,中国仓鼠卵巢细胞(CHO)细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.3 主要试剂

T rizol试剂购自Invitrogen公司。DNA重组工具酶,RT-PCR用酶为 TaKaRa公司产品。HVEM单克隆抗体购自Santa Cruz公司。SYBR GreenⅠ为Biowhittaker Molecular Application公司产品。正丁酸钠购自Sigma公司。

1.4 细胞培养

AAV-293细胞用DMEM培养液、CHO细胞用1640培养液加100 mL/L胎牛血清,110 mL/L丙酮酸钠,2 mmol/L-谷氨酰胺,于 37℃、5%CO2孵箱内常规培养。

1.5 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP/HVEM的构建及鉴定

根据已知的HVEM cDNA序列,设计合成了基因扩增的引物,并在5′端和3′端分引入 EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ限制性酶切位点。上游引物为5′-ACACCGAAT TCATGGAACCTCTCCCAGGAT-3′, 下游引 物 为 5′-TATGTGGATCCTCTGT TGGAGGCTGTCTC-3′。以质粒pcDNA3.1-HVEM 为模板进行PCR扩增后,通过酶切,连接插入带有hrGFP标志的pAAV-IRES-hrGFP表达载体,构建小鼠HVEM表达载体pAAV-IRES-HVEM-hrGFP。以其转化感受态DH5α,氨苄平板筛选。随机挑取单个菌落进行扩增,抽提质粒进行EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切,然后在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳鉴定目的片段是否插入。鉴定正确的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 含HVEM的腺相关病毒的组装

用碱裂解法大量抽提质粒pAAV-IRESHVEM-hrGFP 、pAAV-IRES-hrGFP 、pAAV-Helper和pAAV-RC,测其浓度。将处于对数生长期的AAV-293细胞接种至10 cm培养皿中,待细胞达90%融合、状态良好时采用磷酸钙法将pAAVIRES-HVEM-hrGFP重组表达质粒连同辅助病毒缺陷包装系统(pAAV-RC和pAAV-Helper)共转染AAV-293细胞,继续培养60～72 h后出现明显细胞病变效应(CPE)时即90%～100%的细胞肿胀、变圆,10%～20%的细胞脱壁漂浮,72 h后收集培养上清液和细胞[9]。采用氯仿处理-PEG 8000/NaCl沉淀-氯仿抽提法分离、浓缩、纯化腺相关病毒[10]。

1.7 重组腺相关病毒的纯度鉴定

取10 μ L纯化的病毒液,加等量2×SDS加样缓冲液,煮沸 5 min,冷却至室温,取 10 μ L加样。利用SDS-PAGE电泳鉴定rAAV-HVEM的外壳蛋白,分离胶120 g/L,浓缩胶50 g/L,将凝胶板安置于电泳槽,然后进行点样,按8 V/cm的电压进行电泳,当染料前沿进入分离胶后,电压提高到15 V/cm,直至溴酚蓝迁移至凝胶下端,结束电泳。取出凝胶置于染色盘,考马斯亮蓝振荡染色3 h,脱色液脱色,扫描鉴定。

1.8 重组HVEM-AAV滴度的测定

实时定量PCR法测定rAAV-HVEM的滴度:取 40 μ L 病毒液 ,加入 10 ×DNase缓冲液 20 μ L,无血清 DMEM 133 μ L,40 U DNase Ⅰ-RNasefree 3 μ L,RNAse 4 μ L,37℃孵育2～ 3 h;上述反应液200 μ L加2×蛋白酶 K buffer,蛋白酶 K 10 μ L,37℃孵育1 h;酚∶氯仿∶异戊醇抽提1次,氯仿∶异戊醇抽提1次。再将上述样品沸水浴5 min,立即置于冰上2 min;用PCR缓冲液将标本作不同浓度稀释。荧光定量PCR反应体系如下,模板DNA 1 μ L,10 μ mol/L real-time 引物 1 μ L,master mix 12.5 μ L,H2O 10.5 μ L;PCR 反应条件为:94℃预变性 2.5 min,然后94℃变性 15 s,52℃退火 30 s,72℃延伸30 s,共进行40个循环[11]。

1.9 重组HVEM-AA V感染CH O细胞及HVEM的表达鉴定

接种CHO细胞于10 mL培养瓶中,过夜培养至次日达80%密度。将细胞更换含50 mmol/L正丁酸钠(Sigma公司)的完全1640培养液继续培养2 h。加入不同滴度稀释的纯化rAAV-HVEM病毒,另以AAV空病毒作对照。病毒孵育6 h后,更换不含血清的不完全1640培养液。继续培养观察荧光,72 h后收集细胞,一部分细胞提取RNA进行RT-PCR检测,另一部分细胞用 PBS洗一遍,加HVEM单克隆抗体37℃孵育1 h,PBS洗2遍后进行流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP/HVEM的构建

以质粒pcDNA3.1 HVEM为模板进行PCR扩增后,连接插入pAAV-IRES-hrGFP表达载体,以其转化感受态DH5α,氨苄平板筛选。随机挑取单个菌落,扩增后提取质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ进行酶切分析,筛选出含目的片段的阳性克隆菌株(图1、2)。DNA测序结果显示所克隆的DNA序列与已经报道的HVEM编码序列完全一致。

2.2 重组腺相关病毒rAAV-HVEM的组装

采用磷酸钙法将pAAV-IRES-HVEM-hrGFP重组表达质粒连同辅助病毒缺陷包装系统(pAAVRC和pAAV-Helper)共转染AAV-293细胞,转染48 h后看荧光观察转染效果(图3),转染效率达70%～80%。继续培养60～72 h后出现明显细胞病变效应(CPE)时收集病毒。

图3 pAAV-IRES-HVEM-hrGFP、pAAV-RC和 pAAVHelper共转染AAV-293细胞后荧光表达(×100)Fig.3 The GFP expression of AAV-293 cells co-transfected by pAAV-IRES-HVEM-hrGFP,pAAV-RC and pAAV-Helper(×100)

2.3 SDS-PAGE鉴定重组腺相关病毒的纯度

重组腺相关病毒外壳由3种蛋白组成,分别为VP1、VP2和VP3。3种蛋白质的相对分子质量分别为87、72和62 kD,比例为1∶1∶10。纯化后的重组HVEM腺相关病毒经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后可见到3条特异的条带,其浓度比约为1∶1∶10(图4)。其余杂带不多,表明所纯化的重组HVEM腺相关病毒纯度较高,可以用于动物实验。

图4 纯化后的重组HVEM腺相关病毒SDS-PAGE电泳结果Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis analy ses oftherAAVHVEM virus after purification

2.4 rAAV-HVEM滴度的测定

应用实时定量PCR技术,检测 rAAV-HVEM基因组拷贝数,结果显示经过纯化浓缩的 rAAVHVEM的滴度可以达到5×1010v·g/mL。

2.5 rAAV-HVEM感染CH O细胞及HVEM的表达鉴定

分别将 5×103、5×104、5×105MOI rAAVHVEM病毒和AAV空病毒感染CHO细胞,感染后48 h观察荧光表达率(图5)发现随着病毒滴度的增加转染效率也增加。72 h后收集一半细胞提取RNA做 RT-PCR检测,电泳结果(图 6)显示HVEM表达条带颜色随着病毒滴度的增加而加深。另一半细胞通过流式细胞仪分析HVEM表达量(图7)。显示 rAAV-HVEM 病毒能在体外感染CHO细胞并正常表达HVEM基因。

图5 不同滴度rAAV-HVEM病毒感染CHO细胞的荧光表达(×200)Fig.5 The GFP expression of CHO cells transfected by rAAV-HVEM in different MOI(×200)

图6 RT-PCR鉴定 HVEM RNA在不同滴度 rAAVHVEM感染的CHO细胞中的表达Fig.6 Expression of HVEM mRNA in CHO cells transfected with rAAV-HVEM

3 讨论

图7 不同滴度rAAV-HVEM感染的CHO细胞HVEM表达量流式分析结果Fig.7 Flow cytomytry of HVEM expression in CHO cells transfected by rAAV-HVEM

初始T淋巴细胞活化是通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)和抗原递呈细胞上的抗原肽-MHC分子复合物的相互作用而引起的[12]。抗原识别和多种刺激信号一起决定了 T细胞应答的质量[13]。如果缺乏共刺激信号,T细胞的活化就不是持久的。协同刺激信号在T细胞活化和保护性免疫应答中是必须的,同时免疫抑制信号也在保持T细胞自身耐受和保护自身免疫中扮演着非常重要的角色,因此刺激性和抑制性信号平衡决定着免疫应答结果。共刺激信号系统作为新出现的重要靶点可以弱化自身免疫性疾病或者增强抗肿瘤免疫应答。初始的协同刺激受体属于IG(CD28等)或 TNF受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)超家族[14]。肿瘤坏死因子受体超家族(Tumor necrosis factorreceptor superfamily,TNFRSF)成员具有诱导细胞凋亡,介导炎症反应和自身免疫病的发生等作用。

HVEM是近年来发现的肿瘤坏死因子受体超家族成员,主要表达于T细胞、B细胞和单核细胞,HVEM与其配体结合发挥多种免疫调节作用,与一个配体结合后可改变HVEM空间构象,而影响HVEM与其它配体的结合。HVEM与LIGH T结合作为共刺激信号激活T细胞应答,参与T细胞的增殖与保护性免疫应答;而与BT LA结合则作为共抑制信号抑制T细胞应答,对维持T细胞的耐受及防治自身免疫病具有重要的意义。LIGH THVEM-BTLA通路的发现为免疫调节提供了3个靶点,并有望用于自身免疫性疾病、癌症和感染性疾病的治疗[15]。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是复制缺陷的细小病毒[16],其用于基因转染、表达具有以下特点:感染的细胞范围广,可感染分裂和不分裂的细胞;低免疫原性,低毒性;表达的人蛋白可正确折叠及修饰;定点整合至19号染色体的一个2～4 kb的区域(19q13.32qter),既可避免随机整合可能出现的插入性突变,又可长期稳定表达携带的外源基因[17],但有扩增需要辅助病毒及滴度低等局限性。本实验中我们将从质粒pcDNA3.1 HVEM中扩增出来的小鼠 HVEM的基因片段插入质粒载体pAAV-IRES-hrGFP,进行重组腺相关病毒的组装、纯化,得到了纯度较高的重组腺相关病毒,进一步的实验证明重组病毒颗粒能在体外感染真核细胞并正确表达HVEM分子。

HVEM在炎症反应和抑制信号之间扮演着一个分子开关的角色[15]。用指向于细胞表面受体的激动剂能够恢复内环境的稳定和重新调整免疫和炎症反应的过程,这将有利于治疗自身免疫性疾病,感染性疾病和癌症。可溶性HVEM存在于许多疾病患者的血清中,推测其可能在一些疾病的发生发展中发挥作用,因此在某些疾病的病因分析及治疗中存在着潜在的应用价值。

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