Hedgehog信号通路与Snail在肝癌细胞系中的表达及意义

成薇婷 胡作为 田德英

1武汉市第一医院肿瘤科,武汉 430022

2华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科,武汉 430030

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生是多步骤、多阶段的过程,由多种基因参与,涉及多条信号通路,发病机制目前仍不清楚[1]。Hedgehog(Hh)信号转导通路在胚胎发育、组织极性的调控过程中起重要的决定因素,具有高度保守性。长期以来,研究人员推测与胚胎发育关系密切的信号转导基因在癌变过程中具有重要的作用。最近的研究发现,Hh信号通路的异常持续激活和目的基因的过度表达会导致诸如前列腺癌、基底细胞癌、胰腺癌、结肠癌以及胃癌等多种恶性肿瘤[2]。我们在前期的研究中发现[3],在HCC组织中Hh信号通路活性异常增强,但具体机制尚不清楚,本研究通过检测 Hh信号通路的重要组分——信号肽Shh、Ihh、膜受体 Ptch-1 、Smo、转录因子 Gli-1、Gli-2、Gli-3在各种肝癌细胞株中的表达活性,并分析Hh通路与Snail蛋白之间的关系,初步探讨Hh信号通路与肝癌细胞转移侵袭之间的关系,为进一步研究肝细胞癌的发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人肝细胞株 L02和人肝癌细胞株 HepG2、Hep3B、SMCC-7721和 Huh-7均购自武汉大学典型生物保藏中心,于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,37℃、5%CO2常规培养,每 48 h更换1次新鲜培养液。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM培养液(Hyclone公司),胎牛血清(Gibco公司),Trizol、引物(Invitrogen公司),逆转录试剂盒、核酸分子量DNA Marker(MBI Fermentas公司),TaqDNA 酶(TaKaRa公司),抗Snail多克隆羊抗、抗Gli-2多克隆兔抗(Santa Cruz公司),蛋白提取试剂盒(Panomics公司),ECL发光试剂(Pierce公司),其他常用试剂为国产分析纯。PCR扩增仪(ABI公司),蛋白电泳仪和转膜槽(Bio-rad公司),Image Master VDS凝胶扫描仪及图像分析系统(Pharmacia Biotech公司),PCR基因扩增仪PE9600(PE公司)。

1.3 RT-PCR检测

常规收集生长 72 h的 L02、HepG2、Hep3B、SMCC-7721和Huh-7细胞,用 Trizol抽提,氯仿、异丙醇和乙醇等制备总RNA,UV2201型紫外分光光度计测定A260/A280值在1.8～2.0之间。分别取各组总RNA 1 μ L,在M-MLV逆转录酶的作用下于37℃合成cDNA。应用Premier primer 5.0软件设计 Shh 、Ihh 、Ptch 、Smo、Gli-1 、Gli-2、Gli-3、GAPDH引物序列,由Invitrogen公司合成以及纯化(表1)。按照试剂盒说明书进行PCR反应。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Design of RT-PCR primers

1.4 Western blot检测

采用M-PERTM试剂盒提取新鲜组织蛋白,取20 μ g蛋白进行SDS-PAGE电泳分离,转移到硝酸纤维素膜上,BSA封闭2 h后加入一抗(1∶200)4℃孵育过夜,洗膜3次,加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶2 000)37℃孵育1 h,常规洗膜,ECL荧光显色系统检测,X线片感光显影,扫描分析各蛋白条带结果。

1.5 统计学分析

有人感慨：如果说下水道代表着一座城市的良心，那么报刊亭就是城市文化的“唱诗班”。传承城市文脉，报刊亭的作用不容小觑。城市不能没有报刊亭，城市需要更加美好的报刊亭。

2 结果

2.1 RT-PCR结果

Hh信号通路是一经典的胚胎发育和分化信号系统,近年来研究发现该信号的异常激活在多种肿瘤的发生和发展过程中发挥了重要的作用,但是Hh信号在HCC中的作用尚不清楚。

2.2.1 Snail的表达情况 在肝癌细胞株SMMC-7721细胞中,Snail蛋白表达量较高,但在永生化正常肝细胞L02中,Snail处于低表达状态(图2),两者差异具有统计学意义(P＜0.05)。

海岛是我国海洋国土的重要组成部分，也是海洋经济发展及国防建设的重要基点。海岛工业污染源较少，生活垃圾和生活污水是海岛的主要污染来源；随着海岛的开发和建设大力推进，生活垃圾和污水产量日益增加[1-3]。海岛生活垃圾处理方式和设施的选择，必须根据海岛生活垃圾产生现状和理化特征等基本资料和实际情况进行设计。国内对生活污染源的研究主要集中于内陆农村地区，海岛地区生活污染物排放规律、理化特性研究较少。我国海岛大部分面积较小，多为村镇级海岛。笔者以广东省2个村镇级海岛(外伶仃岛、东澳岛)为研究地点，对生活垃圾产生量、理化特性和生活污水排放系数、污染物浓度进行研究。

2.1.4 Gli mRNA的表达情况 Gli-1 mRNA在SMMC-7721细胞和Hep3B细胞中的表达显著强于 L02细胞,均是其的 2.9倍(P＜0.01),在HepG2细胞的表达量较 L02细胞低(P＜0.01),Huh-7细胞的表达量与 L02细胞无明显差异(P＞0.05);Gli-2 mRNA在L02细胞中几乎不表达,但在4种肝癌细胞系中均呈现较高表达,特别是在SMMC-7721细胞中,表达强度尤为显著,各组表达量与L02细胞相比差异均有统计学意义(均P＜0.01)(图1B);Gli-3 mRNA在所有的肝细胞系中表达强度相似,均较弱,提示在肝癌细胞中该转录因子的活性很低。见图1。

2.1.1 Hh mRNA的表达情况 在5种肝细胞系中Shh mRNA表达程度均较强,其中 Huh-7、SMMC-7721、Hep3B细胞中Shh mRNA的表达强度均高于L02细胞,分别是L02细胞的3.5倍、3.0倍、1.8 倍(均 P ＜0.01,图 1),而 HepG2中 Shh mRNA的表达量与L02相近(P＞0.05)。Ihh在所测的5种肝细胞系中,表达均较弱(图1)。

2.1.3 Smo mRNA的表达情况 Smo mRNA在SMMC-7721细胞中表达量最高,其次是HepG2和Hep3B细胞,分别是L02细胞表达量的3.7倍、3.0倍和2.3倍(均P＜0.01),而Huh-7中Smo mRNA的表达则低于永生化细胞L02(图1)。

2.1.2 Ptch-1 mRNA的表达情况 Ptch-1既是Hh信号肽的膜受体,又为Hh信号通路的目的基因,其表达强度在一定程度上可以代表Hh信号的活性程度。在5种肝细胞系中,Ptch-1 mRNA均有强度不等的表达,其中以SMMC-7721细胞表达强度最高,是L02细胞的2.8倍,在Hep3B细胞的表达也是L02细胞的1.8倍(均 P＜0.01)(图1)。

2.2 Western blot结果

控制器主要负责帮助应用程序稳定运行及接受浏览器的终端的请求。控制器在各个层面中间的工作、把控应用程序各个环节以及处理具体事件方面做出相应。其中的事件包含用户个人行为与信息模型上发生的变化。它接受广大用户的输入并通过模型与视图去满足用户的需求，当用户点击网络页面中的地址或是传送HTML表格时，控制器不进行任何指令，只是单纯的接受请求并决定使用哪个模型组件去处理网络端口传来的请求。随后在进一步决定用哪个视图来呈现模型处理返回的信息。

2.2.2 Gli-2的表达情况 与mRNA表达情况一致,Gli-2蛋白在正常肝细胞株L02中的表达极其微量,而在肝癌细胞株SMMC-7721中,Gli-2的表达量异常增高(图2),两者差异具有统计学意义(P＜0.05)。Spearman秩相关分析显示,在SMMC-7721与L02两种肝细胞中,Gli-2与Snail蛋白表达具有相关性(r=0.503,P＜0.05)。

图2 Western blot检测Snail和Gli-2在L02与SM MC-7721细胞株中的表达差异Fig.2 Differentrial expression of Snail and Gli-2 gene in L02 and SMMC-7721 cells

3 讨论

4种肝癌细胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Huh-7和永生化肝细胞系L02中,Hh信号通路的重要组成成分信号肽Hh(Shh、Ihh)、膜受体(Ptch、Smo)与转录因子 Gli(Gli-1、Gli-2、Gli-3)的 mRNA均有不同程度的表达(图1)。

Hh信号通路有3个同源基因,分别是 Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)和 Desert hedgehog(Dhh),其受体是跨膜蛋白 Ptch。当Hh不存在的时候,Ptch和Smo组成受体复合物。当Hh与Ptch结合后,Smo被激活,并将信号下传,激活转录因子 Gli(Gli-1、Gli-2、Gli-3),后者进入细胞核,启动下游目的基因的表达[2]。Hh信号通过Gli不仅调控细胞的生长、增殖与分化,也参与了肿瘤细胞的增殖和扩散。研究表明,Shh[4-8]或Ihh[9]信号的异常激活可以引起多种肿瘤的形成和发展,如神经管细胞瘤、小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、前列腺癌以及食管癌等。Ptch是Hh信号肽的膜受体,与Hh蛋白结合后,促进信号的下传并激活下游一系列因子,同时Ptch与Gli一样,也是Hh信号通路的目的基因,其表达水平反映了信号通路的活性程度。Berman等[5]采用定量RT-PCR的方法检测了 15例胰腺癌标本,发现Ptch mRNA在胰腺癌组织的表达水平是邻近正常组织的448倍。同样,在胰腺癌细胞系中也发现了 Ptch表达的增强[6]。Ma等[10]发现原发性胃癌中存在Ptch和Gli-1的过表达,利用特异性抗体阻断Shh信号通路后,能抑制5种胃癌细胞的生长。Regl等[11]检测了21例基底细胞癌标本,发现Gli-2的水平是正常角质细胞的2～67倍,并且与Gli-1相互促进表达有助于基底细胞癌的发生。

应用SPSS 12.0统计软件包进行t检验、χ2检验、Spearman等级相关分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

付玉看看天。天上有几只鸟雀飞过，像刀片在她记忆里划了一道黑色的弧线。马路两边的老槐树上，有蝉在叫，叫声像白花花的鱼鳞，瓦片般在地上滚动。

在成熟的正常肝细胞中Hh信号通路处于抑制状态[5],我们发现在4种肝癌细胞株中,与永生化胎肝细胞L02相比,Hh信号通路各组成分子中Shh、Ptch 、Smo 、Gli-1 、Gli-2 的表达大多显著上调 ,说明肝癌细胞的Hh信号通路活性增强。Shh表达活性增高,而Ihh的表达量很低,提示在HCC中,Hh信号通路是以Shh为主要的信号配体。SMMC-7721细胞是具有较高恶性程度和转移活性特征的细胞株,与其他恶性程度和转移活性较低的肝癌细胞株相比,Hh通路活性异常增强,这提示Hh信号通路的激活可能与肝癌细胞的分化、增殖能力以及侵袭力密切相关。最为显著的是,在Hh的各种组成分子中,转录因子Gli-2在SMMC-7721细胞中的表达异常显著,而L02几乎不表达Gli-2,说明在肝癌细胞中,Hh信号通路通过Gli-2激活下游的目的基因的转录,此现象与我们在临床标本中的检测结果一致,并进一步验证了Hh信号通路,特别是核转录因子Gli-2与HCC的恶性程度密切相关。

上皮细胞-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transtions,EMT)是恶性肿瘤细胞黏附、侵袭、转移过程中重要生物学现象,其特征是细胞ECad、α、β、γ-连环素等上皮细胞标志物表达降低或消失,FSP1、波形蛋白、α-SMA和 N-连环素等多种间充质细胞标志蛋白表达,且侵袭和转移能力增强。Snail是一种编码锌指蛋白的转录因子,参与了乳腺癌、卵巢癌、鳞状上皮细胞癌、非小细胞肺癌等肿瘤细胞发生EMT并促进其侵袭转移。Yang等[12]研究发现,Snail不仅可通过下调E-cadherin表达降低细胞黏附力,还可通过上调MMP-2、MMP-9表达增加肝癌细胞的侵袭能力,诱发EM T,促进肝癌细胞侵袭转移。利用特异性阻断剂Cyclopamine阻断胰腺癌细胞中Hh信号通路,可下调Snail表达,显著抑制细胞转移侵袭力[13]。本实验中,SMMC-7721细胞为具有较强侵袭转移特性的肝癌细胞株,其Hh信号通路活性最强。为了进一步明确Hh是否参与了肝癌细胞侵袭转移,我们利用Western blot检测了 Snail和Gli-2蛋白在SMMC-7721和 L02两种细胞中的表达情况。结果显示,在 SMMC-7721细胞中Gli-2的蛋白表达水平显著增高,而L02细胞中Gli-2仅有极微弱表达。与此相同的是,Snail蛋白在SMMC-7721细胞中表达量也显著高于L02细胞,且相关性分析显示,Gli-2的蛋白表达与Snail呈正相关。已知 Hh信号通路可以激活Snail,这提示在肝癌细胞中,异常激活的Hh信号通路可能通过增强Gli-2活性,激活了其下游的目的基因Snail,从而使肝癌细胞具有转移和侵袭的能力,易于向周围组织扩散或转移。

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综上所述,Hedgehog信号通路在肝癌细胞中的异常激活提示该通路在HCC的发病机制中可能起到了重要的作用,积极探讨Hh信号通路对HCC的影响,对HCC的早期诊断和治疗具有深远的意义。

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