小鼠BT LA胞外段腺相关病毒载体的构建和表达*

韩凌斐 王 玲 邱伟民 姚红霞 胡 程 卞 政马衣努尔·买提托合提 方 勇 马 丁△

1同济大学附属第一妇婴保健院,上海 200040

2华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科,武汉 430030

T细胞的活化需要TCR识别抗原肽所提供的第一信号和共刺激分子所提供的协同刺激信号,而共刺激分子又分为具有活化作用的和具有抑制活化作用的两类[1]。B/T淋巴细胞弱化因子(BT LA)是继CT LA-4和PD-1之后,鉴定出的一个新的抑制性Ig超家族受体,具有一个IgV胞外功能区,胞内含有两个酪氨酸免疫抑制基序(ITIM)结构域,当胞内功能区被磷酸化时可以招募蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2[2]。BT LA主要表达在T和B淋巴细胞表面,在巨噬细胞、DC细胞和NK细胞表面也有表达,通过与其配体疱疹病毒进入介质(HVEM)的相互作用产生抑制性信号,下调T、B淋巴细胞的活性[3-4]。基于此背景,通过BTLA胞外段来阻断其与配体HVEM的相互作用可能为未来进行治疗性调控免疫应答提供可行的策略。为此,我们构建了小鼠BTLA胞外段的腺相关病毒载体,期望通过腺相关病毒作为载体的自身优势,为今后进一步研究BTLA胞外段的功能及其应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 腺相关病毒载体系统

腺相关病毒载体系统购自Stratagene公司,包括腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP(含报告基因hrGFP)、辅助质粒pAAV-Helper和包装质粒pAAV-RC。

1.2 动物、质粒、细胞株及抗体

C57BL/6小鼠购自湖北省医学实验动物中心,DH5α菌株由本室保存,病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-H T1080购自Stratagene公司,卵巢上皮细胞(CHO)细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.3 试剂

T rizol试剂购自Invitrogen公司;DNA重组工具酶、RT-PCR用酶为TaKaRa公司产品。

1.4 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA的构建及鉴定

根据已知的BTLA cDNA序列以及推测的胞外段序列进行设计合成了基因扩增的引物,并在5′端和3′端分别引入ClaⅠ、XbaⅠ限制性酶切位点,引物序列:上游引物 5′-CACACATCGAT TGGGAATGAAGACAGTGCC-3′,下游引物 5′-GGTGGTCTAGAAT TAGGCATTGGTGGCATCTG-3′。用T rizol试剂通过RT-PCR从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,提取操作按说明书进行,逆转录的cDNA由上述引物扩增出BTLA胞外段,PCR产物片段经相应的酶切后连接插入带有hrGFP标志的pAAV-IRES-hrGFP表达载体,构建小鼠可溶性BTLA表达载体sBTLA/pAAV-IRES-hrGFP。以其转化感受态DH5α,氨苄青霉素平板筛选,随机挑取单个菌落进行扩增,抽提质粒进行ClaⅠ、XbaⅠ双酶切,然后用琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段是否插入,鉴定正确的克隆送测序。

1.5 含sBTLA的重组腺相关病毒的组装

用碱裂解法大量抽提质粒pAAV-IRES-hrGFP/sBT LA(或 pAAV-IRES-hrGFP)、pAAV-Helper和pAAV-RC,测其浓度。将处于对数生长期的AAV-293细胞接种至10 cm培养皿中,待细胞达70%～80%融合、状态良好时,用钙磷三质粒共转染法将 pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA(或 pAAVIRES-hrGFP)、pAAV-Helper和pAAV-RC 3种质粒以摩尔数1∶1∶1比例,共转染包装细胞AAV-293中合成重组sBT LA-AAV和AAV空病毒,72 h后收集培养上清液和细胞,采用氯仿处理-PEG8000/NaCl沉淀-氯仿抽提法分离、浓缩、纯化腺相关病毒。

1.6 重组腺相关病毒的纯度鉴定

取纯化后的病毒液5 μ L,加等量 2×SDS加样缓冲液,煮沸5 min后用100 g/L SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色检测重组sBTLA-AAV的纯度。

1.7 重组sBTLA-AAV感染滴度的测定

将AAV-HT1080细胞按照3×105/孔密度接种于12孔板,每孔加1 mL培养液,确保细胞分布均匀,37℃孵育过夜,在进行病毒感染前确保细胞达到80%密度。用L-DMEM(20 mL/L胎牛血清+2 mmol/L谷氨酰胺)培养液1∶10倍比稀释纯化的病毒颗粒。加1 mL各稀释度的溶液分散至12孔板中。各稀释度做3个复孔,同时做好无病毒的阴性对照。37℃孵育2 h,孵育期间每隔30 min轻柔涡旋震荡培养板。孵育后每孔加1 mL预温的HDMEM(180 mL/L胎牛血清+2 mmol/L谷氨酰胺),继续培养48 h后用荧光显微镜观察重组sBTLA-AAV感染的细胞。在荧光显微镜下计数某孔荧光细胞的数量n(10＜n＜100),重组 sBT LAAAV感染滴度(U)=n×稀释倍数。

1.8 重组 sBTLA-AAV感染CHO细胞及sBTLA的表达鉴定

接种CHO细胞于10 mL培养瓶中,过夜培养至次日达80%密度。将细胞更换含50 mmol/L正丁酸钠(Sigma公司)的完全DMEM培养液继续培养2 h。加入10-6稀释的纯化重组sBT LA-AAV病毒,另以AAV空病毒作对照,病毒孵育6 h后,更换不含血清的DMEM 培养液,继续培养至72 h后,收集培养上清液并浓缩至1/10体积。加等体积2×SDS上样缓冲液,沸水浴5 min后,上样30 μ L 行150 g/L SDS-PAGE电泳。将凝胶中蛋白电转至PVDF膜上,室温封闭2 h后按化学发光试剂盒说明进行免疫杂交,化学发光底物显色,将结果曝光于X线片上。

2 结果

2.1 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA的构建

将pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA表达载体扩增后提取质粒,用ClaⅠ、XbaⅠ进行双酶切分析,切出长约500 bp和6 kb的两片段,分别为BT LA胞外段和pAAV-IRES-hrGFP的载体片段,而空载体未切出BT LA胞外段的片段(图 1)。对重组质粒pAAV-IRES-hrGFP/sBT LA中插入片段测序,结果显示其序列与已经报道的编码序列完全一致。

图1 重组pAAV-IRES-hrGFP/sBT LA限制性内切酶鉴定Fig.1 Identification of Recombinant pAAV-IRES-hrGFP/sBTLA by restriction endonuclease

2.2 SDS-PAGE鉴定重组腺相关病毒的纯度

重组腺相关病毒衣壳蛋白由3种蛋白组成,分别为VP1、VP2和VP3。3种蛋白质的相对分子质量分别为87、72和62 kD,比例为1∶1∶10,纯化后的重组腺相关病毒液经SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色后可见到3条特异的条带,其浓度比约为1∶1∶10(图2),其余杂带不明显,表明所纯化的重组AAV病毒纯度较高,可以用于动物实验。

图2 纯化后重组sBTLA-AAV SDS-PAGE电泳结果Fig.2 SDS-PAGE of purified recombinant sBTLA-AAV

2.3 重组sBTLA-AAV感染滴度的测定

将纯化的重组sBTLA-AAV病毒颗粒倍比稀释感染AAV-HT1080细胞,在荧光显微镜下计数荧光细胞(图3),经计算纯化后重组病毒的感染滴度为1.8×1010U/mL。

图3 重组sBTLA-AAV感染细胞AAV-HT1080检测病毒滴度Fig.3 T he virus titers of AAV-HT1080 from recombinant sBTLA-AAV-infected cells

2.4 重组 sBTLA-AAV感染CHO细胞及sBTLA的表达鉴定

分别将重组sBTLA-AAV病毒和AAV空病毒感染CHO细胞,感染后72 h的培养上清液浓缩液进行SDS-PAGE电泳,然后转至 PVDF膜上,ECL Western blot法结果显示(图4),在与前者杂交后形成一条非常特异的条带,而后者无特异条带形成,显示重组sBT LA-AAV病毒能在体外感染CHO细胞并正常表达sBTLA基因。

图4 重组sBTLA-AAV感染CHO细胞的Western blot结果Fig.4 Western blot of recombinant sBT LA-AAV-infected CHO cells

3 讨论

T细胞可以从抗原提呈细胞获得第一和第二信号,而第二信号又分为刺激性信号和抑制性信号。B/T淋巴细胞弱化因子(BT LA)是CD28超家族分子中一个新发现的抑制性受体。BTLA组成性表达在CD4+和CD8+的T细胞表面并且在T细胞活化后表达上调。除此以外,BTLA还表达在B细胞、NK细胞、骨髓来源的DC细胞等免疫细胞表面。近年来,肿瘤坏死因子受体超家族中的成员之一单纯疱疹进入介质(HVEM)被确认为是与BT LA相互作用的配体[5]。HVEM不仅表达在静止 T细胞、巨噬细胞和未成熟DC细胞表面,还能表达在内皮细胞上[6]。用抗原受体使BT LA发生交联可以导致抗CD3单抗引起的IL-2分泌减少[7]。BT LA完全缺失的基因敲除小鼠表现出对TCR介导的T细胞活化的高反应性,也同样体现了BT LA作为抑制性分子的重要作用[2]。因此,封闭此途径有可能成为肿瘤免疫治疗的调控靶点。

腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是复制缺陷的细小病毒,它是目前基因治疗及其他基因转移操作中倍受青睐的工具,其用于基因转染、表达具有以下特点:感染的细胞范围广,可感染分裂和不分裂的细胞;病毒滴度高;表达的蛋白可正确折叠及修饰;免疫原性小,引起的副反应相对较少;相对较高生物安全等级,定点整合能保证目的基因的长期稳定表达[8]。由于肿瘤免疫治疗是一个时间较长的复杂过程,因此将AAV作为sBT LA的载体感染宿主肿瘤局部细胞,可望实现sBT LA蛋白在宿主肿瘤局部长期稳定表达,从而有望对宿主产生持续的抗肿瘤作用。

本研究中,我们将从小鼠脾脏扩增出来的BTLA胞外段的基因片段插入AAV骨架质粒载体pAAV-IRES-hrGFP中,进行重组腺相关病毒的组装、纯化,得到了纯度较高的重组腺相关病毒颗粒,并进一步通过实验证明了重组病毒颗粒能在体外感染真核细胞CHO并正确表达BTLA胞外段分子。我们期望通过sBTLA-AAV表达的可溶性BT LA胞外段能够结合HVEM,封闭HVEM上的BT LA结合位点,阻断T细胞表面的BTLA与HVEM的相互作用,阻断抑制信号,从而减弱或解除其对肿瘤特异T细胞的抑制作用,促进T细胞进一步活化,产生更强的肿瘤免疫效应。因此本实验为将可溶性BT LA应用于肿瘤免疫,研究其抗肿瘤作用奠定了基础。

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