补肾通脉方对伴胰岛素抵抗的多囊卵巢综合征大鼠IRS-1表达的影响*

谢 阳 黄冬梅 李 琼 陆付耳 徐丽君邹 欣 龚 菂 邬 姗

华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合研究所,武汉 430030

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)在育龄期妇女发病率为5%～10%[1]。排卵障碍性不孕者中75%与PCOS相关,是无排卵不孕症最重要的原因之一。患者的生殖功能障碍主要表现为雄激素生成过多及卵泡发育障碍。2003年5月欧洲人类生殖和胚胎学会和美国生殖医学会(ESHRE/ASRM)提出了以下诊断标准:超声检查存在多囊卵巢,临床或生化上的雄激素过多症,无排卵性月经失调,符合上述3项中任意2项、并排除其他病因者可以诊断为PCOS[2]。

据统计,75%肥胖的PCOS患者和35%非肥胖的PCOS患者均伴有胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),IR被认为是PCOS的重要病理特征[3]。多项实验研究表明在患有PCOS的女性中,胰岛素活性在经典靶器官(肝脏和脂肪组织等)中缺失从而引起胰岛素抵抗[4]。另外,胰岛素受体还存在于卵巢各种细胞中,表明卵巢也是胰岛素作用的一个重要靶器官。许多研究证实任何针对改善PCOS患者胰岛素抵抗的治疗都可降低睾酮水平和改善排卵功能[5],目前临床PCOS的治疗越来越注重纠正IR[6]。中药补肾通脉方为华中科技大学同济医学院附属同济医院中西医结合科治疗IR的临床经验方。为进一步探讨补肾通脉方通过改善IR治疗PCOS的作用机制,本实验用硫酸普拉睾酮钠加高脂高卡饮食诱导伴IR的PCOS大鼠,观察了补肾通脉方对肝脏和脂肪组织中胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)mRNA的表达,以及肝脏、脂肪和卵巢组织中蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

21日龄清洁级雌性SD大鼠及基础饲料均购自华中科技大学同济医学院实验动物学部。高脂高卡饲料依文献资料[7]略加改动后配制,其中脂肪类(以饱和脂肪酸为主)占总热卡含量的61%,蛋白质占19%,碳水化合物占20%。

1.2 药物和试剂

硫酸普拉睾酮钠由江苏联环药业股份有限公司提供。注射用水由滨湖制药厂提供。补肾通脉方由武汉市同济医院中药房提供,按水煎醇沉的工艺路线提取浸膏,由华中科技大学同济医学院中西医结合研究所制备,浓度为 100%(1 g生药/1 mL)。IRS-1引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成并纯化。β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成并纯化。考马斯亮蓝G250蛋白测定试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。兔抗多克隆IRS-1抗体、多克隆β-actin抗体均购自 Santa Cruz公司。SP试剂盒(兔抗SP及小鼠抗SP试剂盒)购自北京中杉公司。

1.3 动物的分组和处理

21日龄动物普食适应性喂养2 d,随机分为正常组和造模组。其中正常组13只。造模组第23日龄起连续20 d颈背部皮下注射硫酸普拉睾酮钠9 mg/100 g体重+0.3 mL注射用水,正常组大鼠同期注射等量溶剂。正常组予普通饲料80 d,造模组同期予高脂高卡饲料。喂养第70天起晨行连续阴道涂片10 d,观察涂片周期变化。第81天尾静脉采血测空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)和空腹胰岛素(fasting insulin,Fins),计算胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI),ISI采用李光伟等[8]提出的方法:ISI=ln[1/(FPG×Fins)]。造模组取ISI小于正常组ISI均值减1.96倍标准差、且阴道涂片无周期变化者为IR的PCOS大鼠。将IR的PCOS大鼠随机分为模型组和中药组。模型组大鼠27只,中药组大鼠23只。中药组连续2周灌服补肾通脉浸膏12.25 g/(kg·d),同期模型组和正常组灌服等量生理盐水。随机选取正常组 5只,模型组12只,中药组10只大鼠于动情后期禁食12 h后门静脉推注胰岛素(5 U/kg),3 min后依次取肝脏、卵巢及卵巢旁脂肪。各组余下部分在动情后期禁食12 h后处死,分别取上述组织。肝脏、脂肪迅速冻存于液氮,留以检测IRS-1的mRNA和蛋白水平。卵巢用4%多聚甲醛固定,以行免疫组化检测。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 IRS-1 mRNA的表达 采用 RT-PCR检测。取各组大鼠胰岛素刺激前后肝脏和脂肪组织各100 g,用 Trizol提取总 RNA,用 RNA紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。目的因子引物序列见表1,引物序列参照文献[8]。IRS-1的PCR反应时序为:94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸60 s,35个循环后72℃延伸7 min,4℃保存。β-actin反应时序为:94℃变性50 s,55℃退火55 s,72℃延伸50 s,31个循环后72℃延伸10 min,4℃保存。产物各取5 μ L加6×上样缓冲液 1 μ L,1.7%琼脂糖凝胶电泳(60 V,25 min),拍照后用Quantityone软件分析系统分析各条带灰度值。

表1 目的因子PCR扩增的引物核苷酸序列Table 1 Primers used for reverse transcriptionpolymerase chain reaction

1.4.2 IRS-1蛋白在肝脏、脂肪表达的检测 采用免疫沉淀和Western blot方法。取各组大鼠胰岛素刺激前后肝脏和脂肪组织各100 mg用组织裂解液裂解并匀浆;4℃以15 000 r/min离心30 min,取上清作样本,并用考马斯亮蓝G250蛋白定量测定其蛋白浓度,-80℃保存。取各样品蛋白质2 mg,加4 μ g抗IRS-1抗体4℃过夜后加入蛋白A-琼脂(Protein A-agrose)4℃孵育3 h。洗涤免疫沉淀复合物后加入Laemmli上样缓冲液煮沸5 min,6%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDSPAGE)分离蛋白,电转移法使蛋白质转移到硝酸纤维素膜上,用含3%BSA的 TBST溶液(含0.05%Tween-20)37℃封膜1 h后,分别加入用封闭液稀释的抗IRS-l抗体4℃过夜。洗膜后加入用辣根过氧化物酶标记的二抗,室温轻摇1 h,洗膜后用ECL显像曝光,应用光密度扫描仪测各条带密度。

1.4.3 IRS-1蛋白在卵巢表达水平的检测 处死动物后取卵巢组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,4 μ m连续切片。3%H2O2室温孵育 10 min;5%～10%正常山羊血清封闭10 min;加入一抗,37℃孵育1～2 h;滴加生物素标记的二抗,37℃10 min;滴加辣根过氧化物酶标记的链卵白素,37℃10 min;DAB显色,室温 3 min;苏木精复染 1 min;乙醇脱水;中性树胶封片。光镜下判定结果:细胞胞质染成黄色为阳性细胞标志,每张切片在光镜下随机选5个不同视野,以切片染色背景作对照,经标准灰度校正后,采用HPIAS 1000病理图文分析系统(同济医学院千屏影像公司)分析。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 各组大鼠肝脏、脂肪组织中IRS-1 mRNA表达

RT-PCR结果显示,在胰岛素刺激前或后,模型组肝脏、脂肪组织中IRS-1 mRNA的表达明显低于正常组(均P＜0.05)。与模型组相比,中药组肝脏、脂肪中IRS-1 mRNA的表达则明显增多(均P＜0.05)。各组胰岛素刺激后IRS-1 mRNA的表达均较胰岛素刺激前明显升高(均P＜0.05)。见图1,表 2、3。

图1 各组大鼠肝脏、脂肪组织 IRS-1 mRNA表达的比较(RTPCR)Fig.1 The expression of IRS-1 mRNA in the liver and the fatty tissues in all 3 groups(RT-PCR)

表2 各组大鼠肝脏IRS-1 mRNA表达比较(±s)Table 2 Comparison of IRS-1 mRNA expression in liver tissues among 3 g roups(±s)

表2 各组大鼠肝脏IRS-1 mRNA表达比较(±s)Table 2 Comparison of IRS-1 mRNA expression in liver tissues among 3 g roups(±s)

*P＜0.05 vs the normal group;△P ＜0.05 vs the model group;#P＜0.05 vs non-insulin injection

Groups Non-insulin injection With insulin injection Normal 0.833±0.301 1.093±0.351#M odel 0.574±0.136* 0.736±0.294*#T reated 0.649±0.230△ 0.890±0.247△#

表3 各组大鼠脂肪组织IRS-1 mRNA表达比较(±s)Table 3 Comparison of IRS-1 mRNA expression in fatty tissues among 3 groups(±s)

表3 各组大鼠脂肪组织IRS-1 mRNA表达比较(±s)Table 3 Comparison of IRS-1 mRNA expression in fatty tissues among 3 groups(±s)

*P＜0.05 vs the normal group;△P ＜0.05 vs the model group;#P＜0.05 vs non-insulin injection

Groups Non-insulin injection With insulin injection Normal 0.324±0.106 0.470±0.124#M odel 0.075±0.024* 0.164±0.051*#T reated 0.127±0.039△ 0.208±0.094△#

2.2 各组大鼠肝脏、脂肪组织中IRS-1蛋白的表达

Western blot结果显示,在胰岛素刺激前或后,模型组肝脏和脂肪组织IRS-1蛋白表达均明显低于正常组(均 P＜0.01)。中药组肝脏和脂肪组织IRS-1蛋白表达均明显高于模型组(均 P＜0.05)。各组胰岛素刺激后肝脏和脂肪组织IRS-1表达均较刺激前明显升高(均P＜0.05)。见图2,表4、5。

图2 各组大鼠肝脏、脂肪组织 IRS-1蛋白表达比较(Western blot)Fig.2 The ex pression of IRS-1 protein in the liver and the fatty tissues in all 3 groups

表4 各组大鼠肝脏IRS-1蛋白表达比较(±s)Table 4 The ex pression of IRS-1 protein in the liver tissues in all 3 groups(±s)

表4 各组大鼠肝脏IRS-1蛋白表达比较(±s)Table 4 The ex pression of IRS-1 protein in the liver tissues in all 3 groups(±s)

**P＜0.01 vs the normal group;△P＜0.05 vs the model g roup;#P＜0.05 vs non-insulin injection

Groups Non-insulin injection With insulin injection Normal 5.04±0.49 5.44±0.52#Model 2.26±0.20** 2.80±0.27**#Treated 2.76±0.25△ 3.08±0.33△#

表5 各组大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达比较(±s)Table 5 The expression of IRS-1 protein in fatty tissues in all 3 g roups(±s)

表5 各组大鼠脂肪组织IRS-1蛋白表达比较(±s)Table 5 The expression of IRS-1 protein in fatty tissues in all 3 g roups(±s)

**P＜0.01 vs the normal group;△P＜0.05 vs the model group;#P＜0.05 vs non-insulin injection

Groups Non-insulin injection With insulin injection Normal 2.33±0.29 2.47±0.21#M odel 1.61±0.14** 1.99±0.10**#T reated 1.95±0.17△ 2.14±0.19△#

2.3 各组大鼠卵巢中IRS-1蛋白的表达

免疫组化结果表明,IRS-1在卵巢组织间质细胞、卵泡膜细胞、颗粒细胞中均有表达。胰岛素刺激前或后,模型组卵巢IRS-1蛋白表达均明显低于正常组(均P＜0.05)。中药组卵巢IRS-1明显高于模型组(均 P＜0.05)。各组在胰岛素刺激后卵巢IRS-1表达较刺激前明显升高(均P＜0.05)。见表6,图 3。

表6 各组大鼠卵巢IRS-1蛋白表达比较(灰度值,±s)Table 6 Comparison of IRS-1 protein expression in ovary tissues among 3 g roups(g ray value,±s)

表6 各组大鼠卵巢IRS-1蛋白表达比较(灰度值,±s)Table 6 Comparison of IRS-1 protein expression in ovary tissues among 3 g roups(g ray value,±s)

*P＜0.05 vs the normal group;△P ＜0.05 vs the model group;#P＜0.05 vs non-insulin injection

Groups Non-insulin injection With insulin injection Normal 189.97±22.50 195.71±11.59#Model 124.57±18.54* 160.30±13.71*#T reated 148.00±1.47△ 162.01±10.39△#

图3 各组大鼠卵巢中IRS-1蛋白的表达(SP,×400)Fig.3 The expression of IRS-1 protein in the ovary tissues in all 3 g roups(SP,×400)

3 讨论

IR是正常剂量的胰岛素产生低于正常生物学效应的一种状态,即胰岛素对外周组织靶器官的作用减弱,也就是单位浓度的胰岛素细胞效应减弱。它反映胰岛素的糖代谢效应。在胰岛素抵抗时,常伴有胰岛素分泌代偿性增多,故高胰岛素血症被认为是IR的替代性参数。近年国内外对于IR做了大量相关研究,并且在妇产科研究领域也有许多重要发现。正常妊娠本身即为一种IR状态[9],并且妇产科许多疾病病理生理状态都与IR有关,目前IR与PCOS、妊娠高血压、妊娠糖尿病的关系已得到公认[10-12]。

根据祖国医学理论,肾主生殖,以排卵障碍和高雄激素血症为基本临床特点的PCOS多归因于肾精亏虚,肾虚日久还可兼有气虚血瘀。IR病机也在于肾虚血瘀[13],故PCOS和IR具有类似的中医学发病机制。依据肾虚血瘀病变机制自拟的补肾通脉方(黄芪、首乌、肉苁蓉、丹参、仙灵脾、三七 、川芎 、生地、葛根等组成),在临床治疗胰岛素抵抗相关疾病取得较好疗效。以往实验研究也表明补肾通脉方能明显提高高脂饮食诱导的胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感指数,改善胰岛素抵抗[14],其作用机制与促进骨骼肌和脂肪中胰岛素信号转导有关[15-16]。本课题组前期实验也表明补肾通脉方能改善伴有IR的PCOS大鼠胰岛素抵抗状态、提高胰岛素敏感性并促进排卵[17]。

细胞表面胰岛素受体(insulin receptor,InsR)与胰岛素结合后,其酪氨酸残基被磷酸化,从而激活其自身的酪氨酸激酶活性。InsR一旦被激活后可使许多下游底物分子的酪氨酸残基磷酸化,这些底物分子包括IRS蛋白,IRS是一类结构上与胰岛素部分同源并具有胰岛素样活性的多肽,广泛分布于胰岛素敏感组织内[18]。IRS蛋白被磷酸化后即表现出一种特异性结合位点,能与含有SH2区域的蛋白质(SH2蛋白)结合,这些蛋白质有Grb2、SHP2蛋白酪氨酸磷酸酯酶以及最为重要的PI3K。PI3K激酶的激活是启动葡萄糖转运蛋白(GLUT4)转运葡萄糖所必须的。IRS蛋白包括IRS-1,2,3和4,其中尤以IRS-1在胰岛素信号转导中作用最为重要。Rondinone等[19]认为IRS-1含量减少,是高胰岛素血症和IR形成的原因之一。Takano等也认为当IRS-1表达降低或结构、活性发生异常时,胰岛素的胞内信号转导即受阻滞[20]。

我们实验结果显示:各组胰岛素刺激后IRS-1表达均较刺激前增多,表明胰岛素在肝脏、脂肪组织和卵巢中均发挥作用。在IR的PCOS大鼠中,IRS-1在肝脏、脂肪组织中mRNA的表达以及在肝脏、脂肪组织、卵巢中蛋白的表达均明显低于正常,表明在伴IR的PCOS的靶组织中存在着胰岛素信号转导障碍,这可能是导致IR形成和卵巢功能障碍的机制之一。给予中药补肾通脉方治疗后,肝脏、脂肪组织和卵巢中IRS-1的表达明显得到改善,提示补肾通脉方通过改善靶组织中胰岛素受体后信号因子IRS-1转导障碍,改善IR程度,从而改善PCOS的排卵功能障碍。本实验初步阐明了纯中药制剂补肾通脉方能够通过改善胰岛素受体后信号转导来达到提高胰岛素敏感性、改善胰岛素抵抗,并促进排卵。为临床应用中医补肾化瘀法治疗PCOS提供了理论依据。但是IR产生的机制十分复杂,补肾通脉方是否通过多因子或多通道改善IR,有待更深入的研究。

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