应用基因芯片筛选初发和复发鼻咽癌相关基因的观察△

林森 李文峰 张春鸿 方潇碧 方渭清 廖志苏

鼻咽癌是耳鼻咽喉头颈外科最常见的恶性肿瘤之一，放疗是鼻咽癌目前主要的治疗手段，然而初发鼻咽癌(primary nasopharyngeal carcinoma,pNPC)患者即使经过合理放疗和规范的综合治疗后，仍有部分患者出现鼻咽局部和(或)颈淋巴结引流区肿瘤复发，复发率介于8.6%～23.7%[1]。从分子水平探索鼻咽癌相关基因有助于了解癌变机制，从中可能找到特征性肿瘤标记及治疗靶点，是进一步提高鼻咽癌防治水平的方向。本研究以pNPC与正常鼻咽黏膜、pNPC与复发鼻咽癌(recurrent nasopharyngeal carcinoma,rNPC)两组为研究对象，应用基因芯片技术检测两组基因差异表达，分析相关基因及其功能，以探讨pNPC、rNPC癌变分子机制、临床分子诊断以及基因治疗的靶标。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究共收集pNPC 8例，rNPC 5例，正常鼻咽黏膜3例。pNPC组男性5例，女性3例；年龄28～68岁；经病理组织学均确诊为低分化鳞状细胞癌；CT、磁共振成像及发射型计算机断层成像等检查未发现远处转移。rNPC组男性3例，女性2例；年龄45～68岁；首次放疗后2～6年发生局部复发；病理确诊为低分化鳞状细胞癌；经检查未发现远处转移。正常鼻咽黏膜组织3例，均经病理确诊。在电子鼻咽纤维镜直视下取活检组织,分为2份,1份送病理检查,1份马上放液氮中冻存。均由本院耳鼻咽喉科提供。实验分组：pNPC与正常鼻咽黏膜组织和rNPC与pNPC组织。

1.2 方法 采用TRIzol总RNA 提取试剂对两组分别进行组织总RNA提取，用分光光度计测量RNA浓度和纯度，-80 ℃保存备用。利用反转录聚合酶链反应(reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-PCR)，经两轮逆转录成cDNA后，纯化cDNA和片段化单链DNA片，加试剂到片断化的DNA中，混匀，取2 μL样品检测标记效率。在1.5 mL离心管中准备杂交液，混匀，离心，然后在Affymetrix Fluidics Station450洗涤站中洗涤。

Gene array Scanner 3000扫描,经GCOS软件处理给出数据。将GCOS软件读取的芯片数据输入GeneSpring6.1软件分析,根据芯片探针设计特点,设定筛选条件为：以组间2倍以上差异表达为条件且P<0.001分别对pNPC与正常鼻咽黏膜和rNPC与pNPC两组差异基因进行筛选。从差异表达基因中随机选择4 个感兴趣基因,内参采用甘油醛-3-磷酸脱氢酶,采用RT-PCR 检测上述4个基因的表达来验证芯片结果的准确性。

2 结 果

两组标本RNA无降解，质量合格。为获取基因芯片数据准确性，本实验对两组样本分别进行3次重复基因芯片检测，取重复性好的实验结果，检测结果存在大量差异表达基因(见表1)。其中与pNPC相关的基因394个，上调2倍以上161个，下调2倍以上233个；与rNPC发病相关的基因104个，上调2倍以上89个，下调2倍以上15个；RT-PCR验证：实验结果中选取4个基因，结果与基因芯片结果基本一致(见附2页图①)。

表1 用于实时荧光定量聚合酶链反应引物序列、退火温度及产物长度

对差异表达的基因进行聚类分析：pNPC组织和正常鼻咽黏膜组织聚类分析及pNPC组织和rNPC组织聚类分析分别见附2页图②和图③。

利用Gene Ontology对pNPC相关394个基因和rNPC相关104个基因功能进行分类(见附2页图④和图⑤)。分别从2组差异基因表达谱对比中挑选出与pNPC、rNPC相关的可能与癌变相关的基因(详见表2)。

表2 初发、复发鼻咽癌相关的部分上调和下调基因

3 讨 论

基因芯片是一项高通量筛选技术,能同时筛检众多基因的差异表达，提供了从整体上分析肿瘤细胞表达的信息，为肿瘤诊断、预防和治疗提供依据。本研究使用基因芯片筛选pNPC与正常鼻咽黏膜及pNPC与rNPC的差异基因表达，以期发现其癌变分子过程以及可能相关的候选基因。

实验用Affymetrix Gene 1.0 ST芯片检测到与pNPC相关差异基因394个，基因功能涉及蛋白结合和钙离子结合、酶活性相关、免疫相关等 ，可以推测这些基因在pNPC癌变发生过程中可能扮演重要角色。芯片结果发现与pNPC相关的差异基因有S100A9、KRT6B、 LSAMP、TNFAIP3等。Li等[2]通过Western blotting和免疫组织化学方法进一步证实在鼻咽癌组织与正常鼻咽组织中S100A9表达差异有统计学意义；Sengupta等[3]发现keratins家族包括KRT4、KRT6B、KRT14、KRT23和KRT24，在鼻咽癌组织中显著下调；在未分化鼻咽癌以及头颈鳞状细胞癌TNFAIP3高表达，提示TNFAIP3在这些肿瘤发病过程中起重要作用[4]；目前尚罕见报道LSAMP与鼻咽癌有明显相关性，但最近发现其在骨肉瘤中是一个新的抑癌基因[5]。还有学者[6-9]研究发现与鼻咽癌相关的基因有：CCL20在鼻咽癌肿瘤细胞中显著表达，可能是鼻咽癌的一种新的生物标记；潜伏膜蛋白1可能是通过MMP1促进鼻咽癌发生与转移；p63基因是属于鼻咽癌的候选抑癌基因p53的家庭成员之一，p63与细胞分裂周期有关，在鼻咽癌细胞增殖中扮演重要角色，在鼻咽癌组织低表达有显著统计学意义(P<0.05)；LTF在鼻咽癌组织低表达有显著统计学意义(P<0.05)。

本文结果还发现，与pNPC相关差异基因有CCL21、CXCL10、MMP3、MMP12、TNF、MSMB等。其中可能与鼻咽癌发病相关的有CXCL10、MMP3、MMP12和TNF等。如MMP家族促进癌症发生、发展，其中MMP2在中国大陆鼻咽癌患者的易感性方面起重要作用；还有在大多数鼻咽癌肿瘤细胞中可检测到CXCL10显著表达[10-11]等。其他差异基因如CCL21，Mumtaz等[12]通过免疫组织化学方法研究表明了在大肠组织CCL21低表达表明癌变与可能依靠由肿瘤细胞产生调节因子免疫缺陷有关以及在大肠CCL21不同水平表达可能在大肠癌变中有不同机制。然而这些基因是否与初发鼻咽癌有关，有待更加深入研究。

实验还检测到pNPC组织与rNPC组织之间的差异基因数目为104个，涉及功能包含有蛋白结合和钙离子结合、酶活性、细胞外基质、通道和跨膜转运等。研究发现，rNPC相关基因与肿瘤的侵袭、转移以及预后不良明显相关，如CLCA2、S100A8、keratin 17、peptidase inhibitor 3等。有研究[13]结果显示CLCA2作为p53可诱导生长抑制因子，说明它的下调有利于肿瘤细胞生长，与肿瘤预后、治疗有关。 还有S100A8 和S100A9在乳腺浸润性导管癌中过度表达可认为是预后不良的标记之一[14]。van de Rijn等[15]研究发现在肿瘤细胞中keratin 17和keratin 5/6与预后不良有关。因此可以推测CLCA2、S100A8、keratin 17等基因可能与鼻咽癌的复发有关，但仍需进一步研究证实。

综上，筛选pNPC、rNPC癌变相关基因有助于从分子水平阐明其发病机制,进一步发现新的分子诊断指标和基因治疗靶标。如何从本研究结果中寻找对癌变发生起重要作用的相关候选基因，并对这些基因进一步深入研究，有助于pNPC、rNPC分子机制的阐明，并为筛选肿瘤标记物和鼻咽癌基因治疗奠定基础。

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