金丝楸CbuCYP71D15基因克隆及表达分析

摘 要：【目的】通过对金丝楸CbuCYP71D15基因的分子特征和表达模式进行研究分析，为揭示CbuCYP71D15基因在金丝楸心材颜色形成过程中的作用提供参考依据。【方法】基于金丝楸木材样本的转录组数据，采用常规PCR扩增技术克隆获得CbuCYP71D15基因的编码区序列（CDS）全长，利用ProtParam，Protscale，PSORT Prediction等在线工具对CbuCYP71D15基因进行基础生物信息学分析。根据转录组数据，探究CbuCYP71D15基因在边材中的表达水平。同时，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法分析该基因在金丝楸不同组织部位中的表达模式。【结果】成功克隆得到长为1 497 bp的CbuCYP71D15基因序列，生物信息学分析显示该基因编码498个氨基酸，相对分子量为56.5 kD，理论等电点为9.16，是稳定的亲水蛋白，其二级结构主要由α螺旋（46.18%）和无规则卷曲（34.34%）组成，存在跨膜区段。通过序列比对及系统进化分析发现，CbuCYP71D15基因所编码的氨基酸序列与芝麻的同源序列相似度最高，同源蛋白遗传关系最近，且CYP71Ds在进化过程中是保守的，CbuCYP71D15蛋白具有细胞色素P450超家族特征的保守结构域及血红素结合位点，属于CYP71家族。转录组数据分析显示CbuCYP71D15基因在边材中的表达水平与1，4-萘醌类化合物在边材中的表达趋势一致。qRT-PCR分析表明，CbuCYP71D15基因在金丝楸各组织部位均有表达，在边材中表达水平最高，根中表达水平最低。【结论】CbuCYP71D15基因可能在金丝楸心材呈色物质的合成代谢过程中起到羟化作用，可为进一步解析CbuCYP71D15基因在金丝楸中的生物学功能提供依据。

关键词：金丝楸；CYP71D15；基因克隆；表达分析

中图分类号：S781.41 文献标志码：A 文章编号：1673-923X（2024）08-0150-09

基金项目：“十四五”国家重点研发计划项目（2021YFD2200301）；中国林业科学研究院基本科研业务费项目（CAFYBB2023QB001）。

Cloning and expression analysis of CbuCYP71D15 gene from Catalpa bungei ‘jinsi’

XU Yanhong1，2， YU Xiaochi2，3， YI Fei1， WANG Junhui2， LIANG Hongwei1， MA Wenjun2

（1. College of Biological and Pharmaceutical Sciences， China Three Gorges University， Yichang 443002， Hubei， China； 2. Chinese Academy of Forestry， Beijing 100091， China； 3. Northeast Forestry University， Harbin 150040， Heilongjiang， China）

Abstract：【Objective】The molecular characteristics and expression patterns of CbuCYP71D15 gene in Catalpa bungei ‘jinsi’were analyzed to provide a reference for revealing the role of CbuCYP71D15 gene in the formation of ‘jinsiqiu’ heartwood color.【Method】Based on the transcriptome data of ‘jinsi’ wood samples， the full-length coding sequence （CDS） of CbuCYP71D15 gene was cloned by conventional PCR amplification technology. The bioinformatics analysis of CbuCYP71D15 gene was carried out by ProtParam， Protscale， PSORT Prediction and other online tools. Transcriptome data were analyzed to explore the expression level of CbuCYP71D15 gene in sapwood. At the same time， the expression pattern of this gene in different tissues of ‘jinsi’ was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）.【Result】The CbuCYP71D15 gene sequence with a length of 1 497 bp was successfully cloned. Bioinformatics analysis showed that the gene encodes 498 amino acids， with a relative molecular weight of 56.5 kD and a theoretical isoelectric point of 9.16. It was a stable hydrophilic protein. Its secondary structure was mainly composed of alpha helix （46.18%） and random coil （34.34%）， and there was a transmembrane segment. The encoded amino acid sequence was found to have the highest similarity to the homologous sequence of S. indicum by sequence alignment and phylogenetic analysis， and the genetic relationship of homologous proteins was the closest. Moreover， CYP71Ds are conserved during evolution， and CbuCYP71D15 protein had conserved domains and heme binding sites characterized by cytochrome P450 superfamily， it belonged to CYP71 family. Transcriptome data analysis showed that the expression level of CbuCYP71D15 gene in sapwood was consistent with the trend that 1，4-naphthoquinones were significantly higher in GS1 than in GS2 and GS3. The qRT-PCR analysis showed that CbuCYP71D15 gene was expressed in all tissues of ‘jinsi’， and the expression abundance was the highest in sapwood.【Conclusion】The CbuCYP71D15 gene may be involved in the synthesis and metabolism of chromophoric substances in the heartwood of ‘jinsi’. This study can provide a basis for further analysis of the biological function of CbuCYP71D15 gene in ‘jinsiqiu’.

Keywords： Catalpa bungei ‘jinsi’； CYP71D15； gene cloning； expression analysis

金丝楸Catalpa bungei ‘jinsi’为紫葳科Bignoniaceae梓属Catalpa乔木，是我国珍贵用材和园林观赏树种，主要分布于山东、河南、江苏、安徽等省，具有树干通直圆满、出材率高、材质优、耐腐等特性[1]，是中高档家具、乐器和军工等方面的优质用材。此外，金丝楸心材呈金黄色（图1），且占比高达85%以上，纵切面抛光后纹理如金丝，其特殊的心材颜色进一步提高了金丝楸的经济价值。

木材的颜色与其内部含有的次生代谢物有关[2]。梓属植物中的次生代谢物主要有环烯醚萜类、萘醌类、黄酮类和苯酚类等，其中萘醌类化合物主要分布于植物的茎皮和茎木中。植物中的萘醌类化合物基本属于1，4-萘醌，多数含有异戊二烯基，其颜色为黄色至玫红色，酚羟基、甲氧基等助色基团的加入可增强化合物的颜色，引入的基团越多，颜色越深。前期研究表明金丝楸心材中含有丰富的1，4-萘醌类化合物，它们是金丝楸心材的主要呈色物质。其主要在边材中合成，于边心材转换区达到高峰。目前1，4-萘醌类化合物的合成通路尚不完全明确，但羟基化反应是其合成通路中的重要反应之一。

在植物中，细胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450s）蛋白是最大的蛋白质超家族，CYP450s主要通过与多种底物相互作用来参与生物碱、萜类、脂肪酸、植物激素、黄酮类代谢物的初级代谢和生物合成与降解[3-8]。其经典反应是在分子上的非活性碳中心引入一个氧原子来促进羟基化反应[9]。已有研究报道细胞色素P450在植物次生代谢物合成中具有重要作用，Pan等[10]发现SbCYP71AM1参与高粱Sorghum bicolor中高粱酮的生物合成，其能够将5-十五碳三烯基间苯二酚-3-甲醚二羟基化为二氢高粱酮；Seki等[11-12]研究表明甘草Glycyrrhiza uralensis中连续的两步氧化反应由CYP450s催化进行，首先由GsCYP88D6将β-香树脂醇转变为11-羰基-β-香树脂醇，再通过GsCYP72A154的催化将该产物转化为甘草酸。Guo等[13]研究发现丹参Salvia miltiorrhiza中SmCYP76AH1参与铁锈醇的生物合成，使次丹参酮二烯羟基化形成铁锈醇。这些研究表明，植物细胞色素P450的催化活性极其广泛，能在植物体内的多种初级代谢和次级代谢中起作用，特别是生物合成中的羟基化过程。

通过对金丝楸边材样本的转录组与代谢组联合分析，发现金丝楸边材中CbuCYP71D15基因的表达与1，4-萘醌及其羟基衍生物含量积累趋势一致。由此推测CbuCYP71D15基因可能与1，4-萘醌类化合物的合成相关，并在其合成过程中起到了羟基化的作用。为进一步探究金丝楸中CbuCYP71D15基因的相关信息及表达规律，本研究基于金丝楸木材样本的转录组数据克隆获得了CbuCYP71D15基因编码序列（CDS）的全长，并对其编码蛋白的理化性质、结构特征和系统进化进行分析，同时应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术分析CbuCYP71D15基因在金丝楸不同组织部位中的表达模式。以期为探究CbuCYP71D15基因在金丝楸心材呈色物质合成中的调控作用、解析金丝楸心材颜色的形成机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在河南省洛阳市洛宁县伙子村（34°23′08″N，111°40′35″E）完成样品采集。选择3株生长状况一致的21年生金丝楸作为试验材料，从距离地面1.3 m处锯解木材圆盘，并采集金丝楸的根，1、3、5年生小枝及成熟叶片，每个组织部位至少采集10 g，采集的样品迅速用锡箔纸包裹好，置于干冰中速冻寄回实验室，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 目的基因的获取

将木材圆盘的边材部分分解出来，将分解好的金丝楸边材样品，经液氮冷冻后，利用研磨仪（MM400，Retsch）在低温下迅速研磨至粉末状。使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441，天根）提取样品总RNA；并使用微量分光光度计NanoDrop2000 spectrophotometer（Thermo Scientific）检测RNA浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，-80 ℃贮存备用。

cDNA合成使用PrimeScript？ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行，参考试剂盒说明书，在离心管配制反应混合液：Oligo dT Primer（50 μM）1 μL、dNTP Mixture（10 mM each）1 μL、总RNA<5 μg，以RNase-free ddH2O补至总体积为10 μL，65 ℃恒温孵育5 min后，冰上迅速冷却。向上述反应液（10 μL）中加入5×PrimeScript Buffer4 μL、RNase Inhibitor （40 U/μL）0.5 μL，以PrimeScript II RTase （200 U/μL）1 μL、RNase-free ddH2O补至总体积为20 μL。缓慢混匀，42 ℃反转录1 h，95 ℃下酶失活5 min，冰上冷却，置于-80 ℃保存备用。

根据CbuCYP71D15基因的CDS序列，使用Primer Premier 5.0软件设计扩增引物CbuCYP71D15-F/ CbuCYP71D15-R（表1）。以反转录获得的cDNA为模板，通过常规PCR方法克隆基因。PCR扩增体系如下：PrimeSTAR HS （Premix）25 μL，引物F和引物R各2 μL，cDNA模板2 μL，用灭菌双蒸水补足至50 μL。扩增程序：95 ℃下预变性10 min；95 ℃下变性30 s，58 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸90 s；共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳后，将含有目的DNA的琼脂糖凝胶切下，使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit V 4.0试剂盒（TaKaRa）进行目的条带的纯化回收。回收产物连接到T载体（pEASY-Blunt Zero Cloning vector，北京全式金），利用热激法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经菌落PCR检测后，选取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序分析。

1.3 CbuCYP71D15基因编码蛋白分析

通过DNAMAN软件将CbuCYP71D15基因序列翻译为氨基酸序列。利用ExPASy网站中的ProtParam和Protscale在线工具预测分析CbuCYP71D15基因编码蛋白的理化性质和亲疏水性列谱。使用PSORT Prediction进行CbuCYP71D15基因编码蛋白的亚细胞定位预测分析。应用DTU.dk网站中的SignaIP 4.1在线软件预测CbuCYP71D15基因编码蛋白是否具有信号肽。使用SOPMA和SWISSMODEL全自动蛋白质结构同源建模的方法预测分析CbuCYP71D15基因编码蛋白的二级结构和三级结构，利用NCBI Conserved Domians预测分析CbuCYP71D15基因编码蛋白的保守结构域。

1.4 同源分析

将获得的CbuCYP71D15蛋白序列在UniProt网站上进行Blast同源序列比对，寻找其在不同物种中同源性较高的蛋白序列。选择18个不同物种，采用MEGA软件的邻接法（Neighbor-Joining，Bootstrap=1 000）将18个同源蛋白构建进化树[14]。并进一步选取芝麻等同源性较高的其他8个物种的CYP71D亚家族的相关蛋白序列与CbuCYP71D15蛋白序列进行多序列比对分析。

1.5 组织表达特异性分析

提取金丝楸的根，边材，1、3、5年生小枝和成熟叶片的RNA，RNA提取按照RNAPrep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP441，天根）说明书进行。参照PrimeScript？ RT reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒（Takara）说明书，将RNA样品反转录为cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，内参基因选择CfMADH[15]。按照实时荧光定量PCR引物设计规则，使用Primer Premier 5.0软件设计CbuCYP71D15基因的实时荧光定量特异性引物见表2，由生工生物工程（上海）有限公司合成。qPCR反应体系及程序参照2x SYBR Green qPCR Mix试剂盒（北京金百特生物技术有限公司）说明书进行，设置3个生物学重复。荧光定量PCR结果采用2-ΔΔCT方法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 金丝楸CbuCYP71D15基因的克隆

金丝楸边材总RNA提取电泳检测结果显示：RNA条带清晰可见（图2A），说明RNA未降解，完整性较好，可用于后续反转录合成cDNA。基于CbuCYP71D15基因CDS序列设计特异性引物，以获得的cDNA为模板，进行常规PCR，克隆获得CbuCYP71D15基因，将其连接到PUC57载体上转化至大肠杆菌，菌落PCR检测条带位置在1 500～2 250 bp之间，更靠近1 500 bp，与预期大小一致（图2B）。将阳性克隆送测序，测序结果与转录组测序结果一致，CbuCYP71D15基因CDS全长为1 497 bp。

2.2 CbuCYP71D15编码蛋白的基础生物信息学分析

CbuCYP71D15基因的编码序列含有1 497个核苷酸，编码498个氨基酸和一个终止密码子，氨基酸序列如图3所示。ProtParam预测理化性质结果显示CbuCYP71D15编码蛋白的相对分子质量为56 506.83 Da，分子式为C2569H4071N677O716S19，理论等电点为9.16，负电荷的残基总数（Asp+Glu）为54个，带正电荷的残基总数（Arg+Lys）为64个。其脂溶指数为98.06，不稳定系数为37.39。亲疏水性预测分析发现，CbuCYP71D15多肽链第16个与第401个氨基酸位点具有最高与最低疏水性/亲水性分值，分别为2.600与-2.622，其亲水性总平均指数为-0.126（图4A）。亚细胞定位预测结果表明，CbuCYP71D15编码蛋白主要分布于细胞核、细胞质、线粒体，在内质网、过氧化物酶体等也有分布。信号肽预测结果显示该蛋白不存在信号肽（图4B）。

蛋白质二级结构预测结果表明，CbuCYP71D15基因编码蛋白是由α螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲四种结构模式组成，其中α螺旋占比最大，为46.18%，无规则卷曲次之，占比34.34%，延伸链和β-转角分别占14.06%与5.42%（图4D）。因此推测该蛋白的主要二级结构由α-螺旋和无规则卷曲构成。蛋白质三级结构建模结果显示，CbuCYP71D15基因编码蛋白的结构组成主要为α-螺旋，与其二级结构预测结果一致。同时，预测结果显示该蛋白是由一个亲水性球状结构和一个单跨膜锚定位点组成（图4C），其为亲水蛋白。CbuCYP71D15基因编码蛋白保守结构域预测结果可知，CbuCYP71D15蛋白具有细胞色素P450超家族特征的保守结构域及血红素结合位点，说明其为CYP450超家族成员。同时，其具有保守蛋白结构域：CD11072，即CYP71-like家族，本研究认为CbuCYP71D15蛋白是CYP71家族的成员（图4E）。

2.3 CbuCYP71D15的系统发育分析

将CbuCYP71D15基因编码蛋白序列在UniProt上进行Blast同源序列比对，发现CbuCYP71D15蛋白序列与多种植物的相似性达到60%以上，其中，与胡麻科Pedaliaceae的芝麻的相似性最高，达到81.4%，其次是玄参科Scrophulariaceae的松蒿Phtheirospermum japonicum和斑点猴面花Erythranthe guttata，分别为76.3%和74.0%。获取芝麻等18个物种的同源氨基酸序列进行进化关系分析，结果如图5所示，金丝楸CbuCYP71D15蛋白序列与芝麻（XP 011081934.1）聚在同一分支，表明它们之间的同源蛋白遗传关系最近。

利用DNAMAN进行同源序列比对，结果显示：CbuCYP71D15蛋白与芝麻、松蒿等8种同源性较高的植物CYP71Ds蛋白序列具有相似的结构功能域，均包含7个代表序列簇Ⅰ组的E类细胞色素P450蛋白的保守Motif、CD11072保守蛋白结构域和一个基于高度保守的半胱氨酸残基保守位点，即半胱氨酸血红素铁结合位点（Cytochrome P450 cysteine heme-iron ligand signature）（图6），进而推测CbuCYP71D15基因编码蛋白可能与辣薄荷Mentha×piperita等中的CYP71Ds具有类似的功能。同时，保守结构域也进一步佐证了CbuCYP71D15蛋白属于CYP71氏族的成员。

2.4 CbuCYP71D15基因的表达模式分析

基于前期转录组数据，对CbuCYP71D15基因在边材中的表达水平进行分析，结果如图7所示，CbuCYP71D15基因在金丝楸边材所划分的三个区域GS1、GS2和GS3（图1B）中均有表达，且相对表达量差异极显著（P<0.01）。CbuCYP71D15在GS1区域的基因表达水平最高，为50.98；在GS2和GS3区域的基因表达水平都很低，且差异不显著，分别为1.64和1.88。

运用实时荧光定量PCR检测CbuCYP71D15基因在金丝楸不同组织部位中的相对表达量，结果表明，CbuCYP71D15基因在金丝楸的1、3、5年生小枝、根、边材和叶中均有表达，但不同组织部位中的相对表达水平不同。如图8所示，CbuCYP71D15基因在根系中的相对表达量最低，仅为0.13，边材中的相对表达量最高，为1.73，是根系中基因表达量的13.3倍，差异显著。值得注意的是1、3、5年生小枝中CbuCYP71D15基因的相对表达量均显著低于边材，但三者之间的相对表达量差异不显著。

3 结论与讨论

3.1 讨 论

金丝楸材质优良，心材呈金黄色且占比极高，近年来在珍贵硬阔材市场上供不应求，因此，对于金丝楸心材颜色及成材时间方面提出了更高的要求，使金丝楸心材呈色物质及其代谢合成途径的研究也逐步受到关注。木材的不同颜色与其内部含有的各种抽提物有关，通常心材因含较多抽提物而使其材色较深。抽提物中的次生代谢物对木材颜色影响最明显，植物能够合成200 000种以上的次生代谢产物，这些天然产物的形成与次生代谢途径中酶基因的表达密切相关[16]。

在植物基因组中，细胞色素P450家族作为参与生物代谢最大的超家族之一，包括超过1 000个家族和2 500个亚家族[17-18]。根据进化关系，可将植物CYP450s分成11个簇（Clans），两类：单基因家族簇（CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746）和多基因家族簇（CYP71、CYP72、CYP85、CYP86）[19]。本研究中的CbuCYP71D15基因认为是多基因家族CYP71氏族的一员。

本研究成功地从金丝楸中克隆获得了一个细胞色素P450单加氧化酶基因CbuCYP71D15，并通过对CbuCYP71D15编码蛋白进行相关生物信息学分析，发现CbuCYP71D15编码蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，存在跨膜区段。根据蛋白不稳定系数≤40时为稳定蛋白，>40为不稳定蛋白[20]，亲水性总平均值为负值时表示为亲水性蛋白，正值表示为疏水蛋白[21]，推测CbuCYP71D15基因编码蛋白质为一个稳定的亲水性蛋白。此外，参考亚细胞定位结果，结合CYP450s酶是广泛存在于微生物、动植物中与膜结合的血红蛋白类酶[22]，可以进一步推测CbuCYP71D15编码蛋白主要分布在线粒体膜和内质网膜等细胞器膜上。经系统进化树分析和氨基酸多序列比对发现，CbuCYP71D15基因编码蛋白在进化上与胡麻科的芝麻同源蛋白遗传关系最近，具有81.4%的高相似性，与其他植物的CYP71Ds进行比对，显示其功能结构域保守，且都具有CYP71蛋白家族结构域，说明CYP71Ds在生物演变过程中具有高度的保守性，即CbuCYP71D15基因编码蛋白可能具有与其他CYP71Ds类似的使萜类化合物等代谢物羟基化的功能。其中辣薄荷的MpCYP71D15能够将（4S）-柠檬烯羟基化为薄荷醇的前体反式异哌啶醇[23]，莨菪Hyoscyamus muticus的HmCYP71D55参与螺岩兰草酮的生物合成，催化Premnaspirodiene和Solavetivol的连续和独立的羟基化反应[24]。烟草Nicotiana tabacum的NtCYP71D20参与椒二醇的生物合成，催化5-表-马兜铃烯在C1和C3位置的连续和独立的羟基化[25]。由此本研究认为CbuCYP71D15基因编码蛋白可能参与1，4-萘醌及其羟基衍生物的生物合成，并在其中起羟基化的作用。

对转录组数据分析可知，CbuCYP71D15基因在边材GS1中的表达量明显高于GS2和GS3，且GS2和GS3间差异不显著的趋势，与1，4-萘醌类化合物在边材中的含量积累趋势一致，且前期研究表明1，4-萘醌及其羟基衍生物是金丝楸心材呈金黄色的主要物质，并在边材中合成。据此推测CbuCYP71D15基因可能催化1，4-萘醌类化合物的合成。对金丝楸CbuCYP71D15基因在不同组织部位中的表达模式分析发现，CbuCYP71D15基因在边材中的表达水平最高，在根中的表达水平最低，差异显著。而在1、3、5年生小枝中的相对表达水平较边材中低，且相互间相对表达水平差异不显著。结合邓丽萍[26]对楸树边心材生长特性及性质变化规律的研究发现心材于5.26年后才开始形成，推测这一结果可能与心材形成时间在5.26年后有关。

综上所述，本研究对金丝楸CbuCYP71D15基因及其编码蛋白进行了初步探究，通过生物信息学软件分析，结合CbuCYP71D15基因的表达情况，推测CbuCYP71D15基因参与金丝楸心材主要呈色物质1，4-萘醌类化合物的生物合成，并行使羟基化功能。然而，CbuCYP71D15基因编码产物参与1，4-萘醌类物质合成的具体步骤还有待深入研究，后续可通过烟草瞬时转化、体外酶活及同源转化等试验进一步验证。

3.2 结 论

本研究成功克隆了金丝楸CbuCYP71D15基因CDS序列，并分析了CbuCYP71D15基因编码蛋白的基本理化性质和序列结构，认为该基因属于CYP71氏族成员，具有类似于CYP71Ds的羟基化功能。明确了CbuCYP71D15基因在金丝楸中的表达模式，其在边材中表达水平最高，且在边材GS1中的表达量明显高于GS2和GS3。该变化趋势与1，4-萘醌化合物在边材中的含量变化趋势一致，初步认为CbuCYP71D15基因参与金丝楸心材主要呈色物质1，4-萘醌类化合物的生物合成。研究结果可为深入开展金丝楸CbuCYP71D15基因的功能研究，解析金丝楸心材呈色机理提供理论依据。

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[本文编校：罗 列]