葡萄碱基-抗坏血酸转运蛋白(NAT)家族基因的鉴定和表达分析

摘 要 基于最新葡萄基因组数据库，在全基因组范围鉴定葡萄碱基-抗坏血酸转运蛋白（nucleobase-ascorbate transporters，NAT）基因家族成员，并对其进行生物信息学和表达模式分析，为后续深入其功能奠定基础。以Xan_ur_permease结构域（PF00860）保守序列为种子序列筛选NAT基因，分别利用Prot Prama、Clustalx、MEGA 7.0、PlantCare、GSDS 2.0和MEME进行理化性质、多序列比对、进化特征、顺式作用元件、基因结构和蛋白结构分析，并利用公共数据库基因表达数据和qRT-PCR分别分析其在各组织和响应胁迫信号中的表达模式。结果表明，葡萄基因组存在13个NAT家族成员，分别命名为 VvNAT1～ VvNAT13，氨基酸数目、分子质量和等电点分别为304～755、33.01～81.49 ku和8.15～9.6。进化分析将来自葡萄、苹果、拟南芥、水稻和菠萝的NAT蛋白分为4个亚组。结构分析表明，VvNAT基因外显子数目为1～14，其对应蛋白序列中均含有［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］和（QH）两个保守基序。此外，VvNAT基因启动子区域存在响应多种激素和逆境信号的元件。共线性分析表明，葡萄种内存在3个NAT共线性基因对，葡萄和拟南芥种间存在12个NAT共线性基因对。基因表达分析表明， VvNAT1、" VvNAT3、" VvNAT8、" VvNAT11和 VvNAT12在葡萄不同组织各发育时期均具有较高的表达量；200 mmol/L NaCl盐胁迫和4 ℃低温处理后，多个成员差异表达，其中" VvNAT8在茎和根中都显著上调表达。综上所述，葡萄多个NAT基因参与了组织发育和对盐和低温逆境胁迫的响应，而" VvNAT8可能参与组织发育及植株对低温和盐胁迫的响应，可作为后续功能分析的候选基因。

关键词 葡萄；碱基–抗坏血酸转运蛋白；家族基因；生物信息学；非生物胁迫

葡萄（Vitis vinifera" L.）是世界上第三大水果，栽培历史悠久，经济价值较高［1］，但低温、干旱、盐碱等生长环境严重影响葡萄品质以及葡萄产业的健康发展。近年，使用分子手段改良作物，提高植株抗逆性成为热点，因此筛选逆境胁迫相关基因，对提高葡萄品质具有重要意义。

碱基-抗坏血酸转运蛋白（nucleobase-ascorbate transporters，NAT）又被称为碱基阳离子同向转运蛋白（NCS2）［2］，在哺乳动物中可转运抗坏血酸［3-4］，并且被广泛研究；在植物中具有转运嘧啶、嘌呤和尿酸的作用［5］。生物中的核酸转运蛋白一般分为四大类，其中碱基-抗坏血酸转运蛋白（NAT）是最大的一类。NAT家族成员根据对底物的特异性可分为三类，第一类：在细菌、真菌和植物中作用于黄嘌呤或和尿酸［6-7］；第二类：在细菌中作用于尿嘧啶；第三类：在脊椎动物中用于转运L-抗坏血酸［8-9］。前人研究表明，NAT家族成员一般包含400～650个氨基酸残基、10～14个跨膜结构域和两个保守结构域，分别位于跨膜结构域TMS9上游的［Q/E/P］-N-X-G-X-X-X-X-T-［R/K/G］（X为疏水氨基酸）和TMS1中的QH结构域［10-11］。功能研究表明，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，共鉴定出12个NAT家族基因，在其叶、茎、花等组织中均有表达，其中维管束组织表达较高，推测可能与植株的长距离运输有关［12］。在番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）中鉴定出12个NAT基因，在不同生长阶段具有明显的组织特异性［13］。在辣椒（Capsicum annuum L.）中鉴定出12个NAT家族基因，部分基因在根、茎以及果实发育过程中具有重要的调控作用，且对低温和高温具有较强的响应［14］。在苹果（Malus pumila Mill.）中鉴定出14个NAT家族基因，部分基因在茎尖、成熟叶片、幼果和成熟果实中均有表达，且对干旱胁迫和盐胁迫均有响应［15］。

研究表明，NAT基因在植物的生长发育和响应逆境方面具有重要的作用［16］，但目前在葡萄中尚未进行系统的分析研究。因此，本研究采用生物信息学方法在葡萄全基因组中鉴定、筛选NAT家族基因，并对家族成员进行相关数据分析，同时，采用qRT-PCR方法分析葡萄NAT家族基因成员在盐和低温逆境胁迫处理下，在其叶、茎和根中的表达情况，以期为进一步探究葡萄NAT基因的分子机理及葡萄逆境胁迫机制研究提供一个理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

以甘肃农业大学园艺学院保存的‘黑比诺’葡萄（V.vinifera L cv.Pinot Noir）试管苗为试材。配制MS培养基，pH为5.8～6.0，培养容器为150 mL的三角瓶，每瓶分装40 mL培养基。选择生长健壮，无污染的试管苗，在超净工作台剪成1.5 cm左右的带芽茎段，每瓶接种2个，进行培养，培养条件为25 ℃，光周期为16 h/8 h（光照/黑暗），继代培养40 d后，选择生长健壮、大小一致的试管苗，将其转移至含有200 mmol/L NaCl的GS液体培养基中。4 ℃处理在低温植物培养箱中进行，处理时长均为24 h，以正常生长的试管苗为对照，每个处理设3个重复。采集样叶用锡箔纸包裹后在液氮中速冻，而后置于" -80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。

1.2 葡萄NAT家族基因的鉴定

使用 phytozomev12.1：Home（https：//zome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）［17］搜索并下载拟南芥NAT基因的氨基酸序列，在葡萄基因组网站进行同源比对，并下载葡萄NAT家族基因的全长、氨基酸序列和CDS序列。根据NAT基因家族所特有的功能结构域（PF00860），利用在线软件hmmscan search | HMMER进行筛选，删去该功能结构域缺失或不完整的序列。

1.3 葡萄NAT家族基因生物信息学分析

利用ExPASy数据库（https：//web.expasy.org/protparam/）在线软件ProtParam工具，对蛋白质的氨基酸数目、等电点、相对分子质量、不稳定系数、总平均亲水性等基本理化性质数据统计［18］。从Ensembl Pantsl网站获取NAT基因位置及所在染色体长度，利用在线软件（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）绘制染色体定位图。利用WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）在线分析NAT家族的亚细胞定位预测［19］。根据基因登录号在葡萄基因组网站（http：//www.genoscope.cns.fr/cgi-bin/blast_server/projet_ML/blast.pl）查询每个NAT基因上游2 000 bp序列，而后提交于PlantCare在线软件，对序列进行启动子顺式作用元件进行预测分析。利用BAT（http：//www.infspire.org/）工具绘制葡萄种内和葡萄与拟南芥种间的共线性关系［20］。

1.4 葡萄NAT家族基因系统进化关系及基因结构分析

在Phytozome数据库（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）中下载水稻、菠萝、苹果的蛋白序列，利用CLUSTALW和DNAMAN对葡萄NAT基因家族进行多序列比对分析［21］，并通过MEGA7.0，采用邻接法构建NAT基因家族系统发育树，利用在线软件Evolegenius（https：//evolgenius.info//evolview-v2/#login）对NAT基因家族系统发育树进行美化。使用在线软件GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）进行基因结构分析［22］。利用MEME（http：//meme-suite .org/tools/meme）在线软件对葡萄NAT家族进行motif序列分析，预测基序的数量设置为15个。

1.5 葡萄NAT家族基因芯片表达谱分析

在BAR数据库（http：//bar.utoronto.ca/）中，通过NAT基因家族的基因ID检索在葡萄不同时期的芯片数据，基因ID是VIT_217s0000g10090等。筛选相关所需的数据，并使用TBtools软件的HeatMap功能绘制热图。

1.6 葡萄NAT家族基因qRT-PCR分析

引物（表1）由生工（上海）生物工程有限公司合成。采用试剂盒提取葡萄叶片、茎和根的RNA，cDNA合成用（Prime Script RT reagent Kit，Perfect Real Time，，TaKaRa）反转录试剂盒，反转录产物冷藏于-20 ℃，备用。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）用Light Cycler○R

96 Real-Time System （ Roche，瑞士）实时定量PCR仪，对该家族基因的不同处理进行表达量分析。反应体系为20 μL，分别加入ddH2O 6.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1.5 μL，SYBR MIX 10 μL［23］。以VvGAPDH基因（登录号：CB973647）作为内参基因［24］，每个处理设3个重复。试验数据用 Excel 2016和SPSS 26软件分析，利用TBtools和Origin 2022作图。

2 结果与分析

2.1 葡萄NAT基因的鉴定及理化性质分析

通过同源比对分析和NAT特有结构域鉴定，从葡萄基因组中鉴定到13个NAT家族基因成员。将筛选确定的13个葡萄NAT家族成员按照染色体定位的顺序进行命名，依次为 VvNAT1～ VvNAT13。通过绘制13个基因在染色体上的分布图可知（图1），11个成员分布在9条染色体上，2个成员（ VvNAT12、 VvNAT13）分布在未知染色体上。其中Chr1、Chr3、Chr6、Chr8、Chr10、Chr12和Chr13号染色体各分布1个基因，分别是 VvNAT1、 VvNAT2、 VvNAT3、 VvNAT4、 VvNAT5、 VvNAT6和 VvNAT7，Chr17和Chr18染色体分别分布2个，分别是 VvNAT8、 VvNAT9和 VvNAT10、 VvNAT11。

由表2可知，葡萄NAT家族基因氨基酸数目、分子质量和等电点分别为94～755、9.71～81.49 ku和8.15～9.6。其中 VvNAT12的氨基酸数目最少、分子质量最低，与其他成员差异较大，分别为94和9.71 ku，而" VvNAT3的氨基酸数目最多、分子质量最高，分别为755和81.49 ku。" VvNAT3的不稳定系数最高（45.66）， VvNAT7的不稳定系数最低（20.69）。 VvNAT1的等电点最高（9.6）， VvNAT10的等电点最低（8.15）。另外VvNATs基因家族成员的蛋白均为疏水性蛋白，以" VvNAT13的蛋白疏水性最强" （0.579），" VvNAT3蛋白疏水性最低（0.272）。对葡萄NAT家族的编码蛋白进行亚细胞定位，发现主要在细胞膜、细胞质和液泡中表达，而在内质网、高尔基体、细胞核、细胞骨架和叶绿体中表达较少。其中 VvNAT2～ VvNAT10的蛋白均定位于细胞膜上； VvNAT1和" VvNAT11的蛋白分别定位于液泡和叶绿体； VvNAT12和" VvNAT13都定位于细胞质。

2.2 葡萄NAT家族基因多序列比对分析

为了进一步了解葡萄NAT家族基因，对其13个氨基酸序列进行多序列比对分析（图2），发现该家族存在两个保守结构域：TMS9上游的［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］结构氨基酸（除VvNAT4、VvNAT7、VvNAT9、VvNAT13）和TMS1中的（QH）功能氨基酸（除VvNAT4、VvNAT7、VvNAT9、VvNAT12、VvNAT13）。

2.3 葡萄NAT家族成员系统进化分析

为了探索VvNAT家族的进化特性，将拟南芥（14个）、葡萄（13个）、水稻（14个）、苹果（27个）和菠萝（13个）共81个NAT家族蛋白序列进行比对分析，筛选去除分支进化关系较远的13个序列：水稻（3个）、葡萄（2个）、苹果（6个）和菠萝（2个），利用剩余的68个NAT家族蛋白序列构建NAT家族系统进化树（图3）。该68个成员可分为4个亚组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ），其中第Ⅰ亚组包含VvNAT4、VvNAT7、VvNAT9，以及2个拟南芥、4个苹果、2个水稻和3个菠萝的NAT蛋白；第Ⅱ亚组包含VvNAT3，以及2个拟南芥、3个苹果、1个水稻和1个菠萝的NAT蛋白；第Ⅲ亚组包含VvNAT5、VvNAT6、VvNAT11，以及3个拟南芥、6个苹果、3个水稻和3个菠萝的NAT蛋白；第Ⅳ亚组包含VvNAT、VvNAT2、VvNAT8、VvNAT10，以及7个拟南芥、8个苹果、5个水稻和4个菠萝的NAT蛋白。此外，葡萄与双子叶植物苹果聚类于较近的分支中，进化关系较近；而与单子叶植物水稻和菠萝聚类于较远的分支。

2.4 葡萄NAT家族基因结构和保守基序分析

葡萄NAT家族成员的基因结构分析发现：13个NAT基因的结构差异明显，但在亚组内的成员之间基因结构相似，其中内含子数最多的为13个，分别为 VvNAT2、 VvNAT5、 VvNAT6、 VvNAT8、 VvNAT10和" VvNAT11，而 VvNAT4、 VvNAT7和 VvNAT9不具有内含子结构；外显子数最多的为14个，分别为 VvNAT2、 VvNAT5、 VvNAT6、 VvNAT8、 VvNAT10和" VvNAT11，最少为1个，分别是 VvNAT4、 VvNAT7和 VvNAT9。第Ⅰ亚组中包含3个成员， VvNAT4、 VvNAT7和 VvNAT9均只有1个外显子，无内含子；第Ⅱ亚组有3个成员，其中" VvNAT3所含外显子数和内含子数最多，分别为9和8，VvNAT12含外显子数和内含子数最少，分别为2和1，" VvNAT13含外显子数和内含子数分别为7和6；第Ⅲ亚组的3个成员分别为VvNAT3、VvNAT12和" VvNAT13，均有14个外显子和13个内含子；第Ⅳ亚组中包含4个成员，其中 VvNAT2、" VvNAT8和 VvNAT10均有14个外显子和13个内含子， VvNAT1有13个外显子和12个内含子。

利用MEME软件蛋白序列进行motif预测，共发现15个保守基序，基序含21～50个氨基酸（图4），其中motif10含氨基酸数最少，为21个；motif1、motif6、motif8、motif12、motif13和motif15所含氨基酸数最多，为50个。N端是motif8和motif12，其中motif8中含（QH）功能氨基酸；C端是motif9。在 VvNAT1、 VvNAT2、 VvNAT3、 VvNAT5、 VvNAT6、 VvNAT8、 VvNAT10和 VvNAT11中存在motif2，其中包含［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］结构氨基酸。此外，4个亚组中均有motif14保守基序，Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ 3个亚组中同一亚组内基因编码蛋白的保守基序具有相似性，Ⅱ亚组内基因编码蛋白的保守基序存在差异；Ⅲ和Ⅳ亚组NAT保守性相对比Ⅰ和Ⅱ亚组NAT保守性高。

2.5 葡萄NAT家族成员启动子顺式作用元件

将葡萄NAT家族基因启动子上游2 000 bp的碱基序列提交至在线软件PlantCare进行预测分析，而后筛选与激素和逆境胁迫相关的顺式作用元件。发现存在多种激素反应元件，包括水杨酸响应元件（TCA-element）、赤霉素响应元件（GARE-motif、TATC-box和P-box）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif和CGTCA-motif）、脱落酸响应元件（ABRE）、生长素响应元件（AuxRR-core和TGA-element），与环境信号相关的包含厌氧诱导响应元件（ARE）、干旱诱导响应元件（MBS）和防御与胁迫响应元件（TC-rich repeats）。由图5可知，13个VvNAT基因中，" VvNAT2、nbsp; VvNAT5、" VvNAT7、" VvNAT8、" VvNAT9和" VvNAT13含有TCA-element， VvNAT1、" VvNAT3和" VvNAT11含有GARE-motif， VvNAT1、 VvNAT2、" VvNAT5、 VvNAT10和 "VvNAT11含有TATC-box， VvNAT2、 VvNAT6、 VvNAT11和 VvNAT12含有P-box， VvNAT1、" VvNAT3、" VvNAT4、" VvNAT6、" VvNAT8和 VvNAT9含有TGACG-motif，" VvNAT3和" VvNAT11含有CGTCA-motif，VvNAT1、VvNAT5、VvNAT6、VvNAT10和" VvNAT11含有ABRE， VvNAT10和" VvNAT11含有AuxRR-core，因此推测葡萄NAT基因家族与植物激素响应密切相关；13个VvNAT基因均含有ARE，其中VvNAT5、VvNAT8、VvNAT9和 VvNAT10含有MBS，VvNAT1、VvNAT2、VvNAT7和" VvNAT13含有TC-rich repeats，因此推测葡萄NAT基因家族与环境信号和防御与胁迫响应密切相关。

2.6 葡萄NAT家族基因芯片表达谱分析

通过对葡萄基因芯片数据进行分析，得到葡萄NAT家族基因成员在不同组织各发育时期的基因表达谱，并利用TBtools软件绘制基因表达热图（图6）。结果显示，葡萄NAT家族基因成员的不同亚组在不同组织或同组织的各发育时期表达量存在差异。第Ⅰ亚组的3个成员在各个组织中的表达量明显低于其他亚组，其中 VvNAT7在成熟叶片、木质化茎、采收后3个月内果皮和采收后3个月外果皮中高表达；第Ⅱ亚组中，" VvNAT3和 VvNAT12在卷须、叶片、幼苗、幼茎、花、花序轴、种子、果皮和果肉等组织中表达量均较高，且随着组织的成熟和衰老表达量逐渐降低，而" VvNAT13的表达量相对较低；第Ⅲ亚组中，" VvNAT5和" VvNAT6的表达量均较低，而" VvNAT11在卷须、茎、花、果肉、种子、中表达量较高，且随组织成熟和衰老表达量降低；第Ⅳ亚组中， VvNAT2和 VvNAT10在各组织中表达量均很低，而" VvNAT8在幼苗、幼茎、幼花、坐果期的卷须、花序轴、种子、坐果后期的果肉组织中高表达量高， VvNAT1在中度成熟果肉后期的组织中表达量较高。综上可知， VvNAT1、" VvNAT3、" VvNAT8、" VvNAT11和 VvNAT12在葡萄不同组织各发育时期都具有较高的表达量。

2.7 葡萄NAT家族基因共线性分析

对葡萄NAT家族基因进行种内共线性关系分析（图7-A），发现葡萄种内基因成员之间存在复制现象，其中葡萄13个NAT基因中 VvNAT2和 VvNAT10、" VvNAT11，" VvNAT4和 VvNAT7之间共线性较强。对葡萄和拟南芥进行种间共线性关系分析（图7-B），发现葡萄和拟南芥种间也存在复制现象，存在12个重复的基因对，分别分布于拟南芥4条染色体和葡萄的7条染色体上。其中葡萄Chr1染色体上的基因和拟南芥Chr1上的基因、葡萄Chr6、Chr10和Chr18染色体上的基因和拟南芥Chr2染色体上的基因、葡萄Chr8和Chr13染色体上的基因和拟南芥Chr3、Chr5染色体上的基因、葡萄Chr17染色体上的基因和拟南芥Chr1、Chr5染色体上的基因之间共线性较强。葡萄Chr3、Chr8和ChrUn染色体上的基因和拟南芥染色体上的基因没有共线性（图7）。

2.8 葡萄NAT家族成员qRT-PCR分析

对葡萄NAT家族成员在不同逆境胁迫处理下的相对表达量进行分析，发现各亚族基因的相对表达量差异显著（图8）。

200 mmol/L NaCl处理后，第Ⅰ亚组的3个家族成员" VvNAT4、 VvNAT7和 VvNAT9在茎中的表达量与对照相比均呈显著上调，分别是对照的72倍、8.7倍和4 635倍。第Ⅱ亚组的3个家族成员" VvNAT3、VvNAT 12和" VvNAT13在茎中的表达量与对照相比均呈显著上调，尤其" VvNAT13是对照680倍；在叶中的表达量与对照相比不显著；" VvNAT3在根中的表达量与对照相比呈显著上调， VvNAT12和" VvNAT13在根中的表达量与对照相比则不显著。第Ⅲ亚组成员包括" VvNAT5、" VvNAT6 和" VvNAT11，其中" VvNAT5和" VvNAT11在茎中的表达量与对照相比呈显著上调，" VvNAT6在茎中的表达量与对照相比不显著。 VvNAT5、 VvNAT6和" VvNAT11在叶和根中的表达量与对照相比均无显著变化。第Ⅳ亚组包含4个基因，为 VvNAT1、 VvNAT2、" VvNAT8和 VvNAT10，其中 VvNAT1、 VvNAT8和 VvNAT10在茎中的表达量与对照相比均呈显著上调， VvNAT2则不显著； VvNAT1、 VvNAT2和" VvNAT8在根中的表达量与对照相比均呈显著上调， VvNAT10则不显著； VvNAT1、 VvNAT2、" VvNAT8和 VvNAT10在叶中的表达量与对照相比均不显著。4 ℃低温处理后，13个葡萄NAT家族成员中除" VvNAT8在茎和根中的表达量与对照相比呈显著上调外，其他在叶、茎和根中的表达量与对照相比均不显著。

综上可知，葡萄NAT基因在200 mmol/L NaCl盐逆境胁迫处理下，在叶的表达量与对照相比均不显著，在茎和根中的表达量与对照相比呈不同程度的显著上调，其中 VvNAT9在茎中的表达量上调最为显著，" VvNAT8在根中的表达量上调最为显著。在4 ℃低温逆境胁迫处理下，除" VvNAT8在茎和根中的表达量与对照相比呈显著上调外，其他在叶、茎和根中的表达量与对照相比均不显著。

3 讨" 论

碱基–抗坏血酸转运蛋白（NAT），普遍存在于植物、原核生物、真菌和哺乳动物中，因其转运抗坏血酸的功能，所以在哺乳动物和微生物中研究较多。植物中最早发现该转运蛋白的是Schultes等［7］，Burzle等［25］研究表明，SVCT1和SVCT2转运蛋白对抗坏血酸具有特异性。Argyrou［6］等研究发现，玉米中该转运蛋白主要参与转运尿酸和黄嘌呤。Hunt［26］和Niopek-Witz等［27］研究发现，NAT在拟南芥中主要参与腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶以及次黄嘌呤的转运。近年来，关于碱基–抗坏血酸转运蛋白（NAT）在植物中的研究逐渐增多，发现其在维持植物正常生理代谢中发挥重要作用［28］。

本研究从葡萄全基因组中共鉴定出13个家族基因成员，与拟南芥（12个）［12］、番茄（12个）［13］、辣椒（12个）［14］、苹果（14个）［15］的NAT家族成员数目相近，说明葡萄NAT家族基因在进化过程中相对保守。葡萄中鉴定出的13个基因分为4个亚组，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚组分别包含3个家族成员，第Ⅳ亚组包含4个家族成员。葡萄NAT家族氨基酸数量存在较大差异，为304～755，分子质量为33.01～81.49ku，其编码蛋白均为碱性蛋白，这与辣椒中的研究结果相似［13］。结合进化树和基因结构进行分析，发现第Ⅰ亚组的3个基因无内含子，第Ⅱ亚组的 VvNAT12只有1个内含子，这可能是由于在进化过程中内含子大量丢失，基因结构保持稳定，加速CCAAT-box的转录，促进基因的表达有关［29］。多序列比对发现葡萄NAT家族成员对应蛋白序列中均含有［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］和（QH）两个保守基序，但部分基因的结构域丢失，推测可能与物种所处的环境压力有关。整体而言，葡萄NAT家族成员在［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］结构氨基酸中，第一个氨基酸均为E，故而可推测其在葡萄中的转运底物为核酸，这与苹果NAT转运蛋白可能主要转运核酸类物质的研究结果相同［30］。对NAT家族基因启动子上游2 000 bp的碱基序列进行预测分析，发现存在多种激素反应元件和环境信号相关的元件，说明该家族基因表达调控机制复杂［31］，在苹果的研究中，已经证实MdNAT基因响应干旱胁迫与盐胁迫。在辣椒的研究中也发现其第一亚组的3个基因在所研究的器官和组织中整体表达量明显低于其他亚组，其中3个CaNAT基因对盐胁迫有不同程度地响应，6个CaNAT基因对低温胁迫有不同程度地响应。而在番茄中，B亚组的3个基因 SlNAT149在栽培种中不表达，在野生种中低表达。葡萄NAT基因在不同组织中的表达分析发现，不同组织或同组织的各发育时期表达量存在差异，尤其在茎、花、果肉、种子、卷须中的表达量较高，并随组织的成熟衰老表达量逐渐降低。共线性分析表明，葡萄种内13个NAT基因中 VvNAT2和 VvNAT10、" VvNAT11，" VvNAT4和 VvNAT7之间共线性较强，葡萄和拟南芥两个种间NAT基因中，葡萄Chr1、Chr6、Chr8、Chr10、Chr13、Chr17和Chr18染色体上的基因和拟南芥染色体上的基因有较强共线性，葡萄Chr3、Chr8和ChrUn染色体上的基因和拟南芥染色体上的基因没有共线性。

通过qRT-PCR技术分析葡萄NAT家族基因成员在盐和低温逆境胁迫处理下的抗性，结果表明，该家族基因在叶、茎、根不同组织中对盐和低温两种逆境胁迫的响应程度有差异。200 mmol/L NaCl处理下，在叶中的表达量与对照相比均不显著；除 VvNAT2和 VvNAT6，其他基因在茎中的表达量均呈显著上调；" VvNAT1、 VvNAT2和" VvNAT8在根中的表达量呈显著上调。4" ℃低温处理下，在叶、茎、根组织中，只有" VvNAT8在茎和根组织中的表达量与对照相比呈显著上调，其他则均不显著。因此推测葡萄NAT基因在盐和低温胁迫下具有不同程度的响应，尤其对盐胁迫具有较强的响应，这与盐胁迫下， Vvnac17过表达系的发芽率和根长均高于野生型植株的研究结果相似［32］。

本研究获得的信息有助于提高对葡萄NAT家族基因的认识，本研究对13个VvNATs进行了鉴定和分析，并将它们的蛋白质分成4个亚组，这些亚组具有共同的外显子/内含子结构、系统发育和保守基序的分布。qRT-PCR分析结果表明，200 mmol/L NaCl盐胁迫和4℃低温处理后，葡萄多个NAT基因参与了组织发育和对盐和低温逆境胁迫的响应，而" VvNAT8可能参与组织发育及植株对低温和盐胁迫的响应，可作为后续功能分析的候选基因。尽管，文中对葡萄NAT基因的功能还没有得到充分的描述，但本研究的发现为今后葡萄NAT家族功能研究和参与植物适应胁迫条件提供了一个理论依据。

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Identification and Expression Analysis of Nucleobase-ascorbate Transporter （NAT） Family"" Gene" in Grape

LAN Guanquecailang，GUO Lili，MA Weifeng，MAO Juan and CHEN Baihong

（College of Horticulture，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070， China）

Abstract Based on the latest grape genome database，members of the nucleobase-ascorbate transporters （NAT） family" gene" were identified on a genome-wide scale and subjected to bioinformatics and expression pattern analysis，laying a foundation for further functional investigation.The conserved sequence of the" Xan_ur_permease domain （PF00860） was used as a seed sequence to screen NAT genes.Prot Prama，Clustalx，MEGA 7.0，PlantCare，GSDS 2.0，and MEME were used to analyze physicochemical properties，multiple sequence alignment，evolutionary characteristics，cis-acting elements，gene structure，and protein structure.The expression patterns of these genes in various tissues and in response to stress signals were analyzed using public database gene expression data and qRT-PCR.The results showed that there were 13 NAT family members in the grape genome，denoted as"" VvNAT1-VvNAT13，with the number of amino acids，molecular mass，and isoelectric point ranging from 304-755，33.01-81.49" ku，and 8.15-9.6，respectively.The phylogenetic analysis divided the NAT proteins from grape，apple，Arabidopsis thaliana，rice，and pineapple into four subgroups.Structural analysis showed that the number of VvNAT gene exons ranged from 1 to 14，and the corresponding protein sequences contained two conserved motifs，［（Q/E/P）NXGXXXXT（R/K/G）］ and" （QH）.Moreover，the VvNAT gene promoter region contained elements responsive to various hormones and stress signals.The collinearity analysis showed that there were three NAT collinear gene pairs within the grape species，and 12 NAT" collinear gene pairs between grape and A.thaliana.Gene expression analysis showed that"" VvNAT1， VvNAT3， VvNAT8， VvNAT11，and" VvNAT12 had high expression levels in different tissues and developmental stages of grape.After 200 mmol/L NaCl salt stress and 4" ℃ low temperature treatment，multiple members were differentially expressed，among which" VvNAT8" was significantly up-regulated in both stems and roots.In summary，multiple NAT genes in grape are involved in tissue development and response to salt and low-temperature stress，while" VvNAT8" may be involved in tissue development and plant response to low temperature and salt stress，and can be used as a candidate gene for subsequent functional analysis.

Key words Grape; Nucleobase-ascorbate" transporters; Family gene; Bioinformatics; Abiotic stress

Received "2023-09-13 """Returned 2023-11-22

Foundation item 2022 Silk Road Science and Technology Project for Cold and Drought Agriculture （No.GSLK-2022-4）.

First author LAN Guanquecailang，male，master student.Research area： stress physiology and growth regulation of fruit trees.E-mail： 3501317931@qq.com

Corresponding"" author CHEN Baihong，male，professor，doctoral supervisor.Research area： stress physiology and growth regulation of fruit trees.E-mail： bhch@gsau.edu.cn

（责任编辑：史亚歌 Responsible editor：SHI Yage）