抗氧化途径下大豆GmbHLH130转录因子增强植物耐旱性研究

摘 要 为了探究大豆" GmbHLH130基因参与植物耐旱性调控的分子机制，分析了转基因拟南芥在干旱处理下的表型并测定活性氧含量和抗氧化酶活性，同时检测了拟南芥叶中干旱应答相关基因的表达模式以及转录因子GmbHLH130对下游基因启动子的结合作用。结果显示，" GmbHLH130基因过表达拟南芥的耐旱性明显增强。干旱处理下，过表达株系鲜质量和叶片相对含水量均高于WT，而MDA含量和失水率则较低。此外，干旱处理导致拟南芥过表达株系积累更多的可溶性糖和脯氨酸、更少的活性氧以及更高的抗氧化酶活性；同时，干旱胁迫应答基因AtCAT、AtPOD、AtSOD、" AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29A的表达水平在过表达株系中显著上调。GmbHLH130蛋白则可结合到靶基因的启动子区激活GUS报告基因的表达。本研究初步证明GmbHLH130转录因子通过结合干旱胁迫应答基因启动子激活基因表达，增加转基因植株体内渗透调节物质含量、激活抗氧化途径和提高ROS清除能力，最终缓解干旱胁迫对植株的损伤。

关键词 大豆；转录因子；bHLH；拟南芥；耐旱性

干旱胁迫是限制干旱和半干旱地区植物生长、发育和产量的主要环境因素之一［1］。在长期的进化过程中，植物在形态、生理和分子调控水平上形成了一系列复杂的机制来应对干旱胁迫［2］。植物对干旱胁迫的响应涉及复杂的基因调控网络，其中，转录因子作为干旱信号转导途径的核心组成部分，通过激活或抑制下游靶基因的表达，在调节植物对干旱胁迫的适应过程中发挥重要作用［3-4］。

碱性螺旋-环-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）蛋白组成了植物第二大转录因子家族［5］。bHLH转录因子家族的成员包含两个高度保守且功能不同的结构域：碱性结构域和HLH结构域。位于bHLH结构N端的基本结构域由约15个碱性氨基酸残基组成，负责与靶基因启动子区的G-box或E-box元件结合；HLH结构域位于bHLH结构的C端，对蛋白互作非常重要［6］。植物bHLH转录因子参与生长发育相关多种生物学过程，包括调节种子休眠［7］和萌发［8］、开花时间［9］、果实成熟［10］、植物次生产物合成和木质部的发育等过程［11］。此外，bHLH转录因子在植物对干旱、盐、寒冷和重金属等非生物胁迫的响应中发挥重要调控作用［12］。干旱、盐和渗透胁迫诱导拟南芥" AtbHLH122基因表达上调，拟南芥 atbhlh122突变体对盐和渗透胁迫的敏感性增加，而" AtbHLH122基因过表达则增强植株对干旱、盐和渗透胁迫的耐受性［13］。番茄" SlbHLH22基因过表达可提高番茄植株次生代谢物和渗透调节物质的含量，增强活性氧（ROS）清除能力，进而增强番茄植株的耐旱和耐盐性［14］。日本百脉根" LjbHLH34基因的表达受PEG和ABA诱导表达上调，该基因过表达可通过激活抗氧化酶编码基因、增强相应的抗氧化酶活性正调控植物的耐旱性［15］。苹果" MdbHLH130异源过表达则通过调节气孔闭合和ROS清除增强转基因烟草植物的耐旱性［16］。因此，探究植物bHLH家族成员在干旱等非生物胁迫中的功能和分子机制对作物的分子育种具有重要意义。

大豆是中国重要的粮油作物，其富含蛋白质，是食用油、植物蛋白和动物饲料的关键原料，但是大豆苗期生长易遭受干旱胁迫，直接影响其生长发育和后期产量。随着全球可支配淡水资源的逐年减少，农业灌溉用水也十分紧缺。因此，提高植物耐旱性对于农业的可持续发展越来越重要。通过转基因育种和基因编辑育种技术培育高产高抗逆新品种是一种高效快捷的方式，但是这一目标的实现需要基于功能已知的候选基因。尽管已有一些大豆基因被报道参与大豆对干旱胁迫的响应。然而，仍有很多可能参与大豆干旱响应调控的基因有待发掘。已有报道显示，bHLH转录因子家族在大豆中包含308个成员；其中，少部分大豆bHLH蛋白的功能被研究，如大豆 GmORG3的过表达则可增加铁离子由根到地上部的转运，同时减少镉向地上部的运输从而增强植物对重金属镉胁迫的耐受性［17］。大豆bHLH家族成员GmPIB1则通过直接结合到活性氧（ROS）产生关键酶基因" GmSPOD1启动子区抑制其表达，减少ROS的积累，增强大豆转基因植株对大豆疫霉菌的抗性［18］。本研究基于参与植物非生物胁迫调控的拟南芥" AtbHLH122基因和氨基酸序列，在大豆基因组中比对鉴定出其同源基因" GmbHLH130，该基因表达水平受干旱胁迫诱导显著上调。进而通过转基因技术、生理生化测定和分子生物学手段揭示GmbHLH130对于提高转基因拟南芥的耐旱性非常重要。GmbHLH130蛋白可结合干旱胁迫应答基因启动子激活靶基因的表达，增加转基因植株体内渗透调节物质含量、激活抗氧化途径和提高ROS清除能力，最终缓解干旱胁迫对植株的损伤。本研究将为大豆干旱胁迫应答的转录调控机制研究提供新的思路，同时为耐旱大豆的分子改良提供候选基因。

1 材料与方法

1.1 转基因拟南芥耐旱性鉴定

野生型拟南芥和" GmbHLH130过表达株系（两个独立株系L1和L2，均为T3代纯合子）的种子经75%乙醇表面消毒后，播种于泥炭土和蛭石混合（1∶1）基质，在4 ℃冰箱春化3 d，移至植物生长室培养。生长室条件：温度25" ℃，空气相对湿度60%～70%，长日照（昼16 h/夜8 h）。2周后挑选长势较一致的植株进行处理，每个处理6盆，每盆种植4株；首先浇大量水使基质吸水饱和，然后倒掉多余的水，后停止供水，使其自然干旱10 d，观察野生型和过表达株系的生长情况。叶片丙二醛（MDA）含量测定参考Huang等［19］报道的方法。测定叶片相对含水量时取叶片称取其鲜质量（FW）；将叶片浸没在去离子水中，放置在4 ℃冷藏箱12 h，擦干表面水后再次称量（TW）；将叶片在75 ℃烘箱烘干，再称其干质量（DW）；叶片相对含水量=（FW-DW）/（TW-DW）%。取正常生长的野生型和转基因拟南芥植株的叶片测定叶片失水率，将叶片剪下后立刻称量（FW0），然后将叶片平铺于试验台上，保持温度为25 ℃、空气湿度为60%～70%，每隔1 h称量1次（FWt），失水率=（FW0- FWt）/FW0×100%。

1.2 DAB和NBT染色及H2O2含量测定

DAB（3， 3′-Diaminobenzidine）能够和H2O2反应生成红棕色沉淀，NBT（Nitrotetrazolium blue）能够和O-2反应生成蓝色化合物［6］。将拟南芥叶片剪下分别放入DAB染液（DAB粉末50 mg溶于50 mL 50 mmol/L PBS溶液，使用0.1 mmol/L HCl调节pH至3.8）和NBT染液（NBT粉末100 mg溶于50 mL 50 mmol/L PBS溶液），室温染色过夜，使用75%乙醇脱色后观察活性氧染色情况。叶片H2O2含量和抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性使用对应的试剂盒测定（南京建成）。

1.3 总RNA提取和定量PCR

使用20% PEG溶液、200 mmol/L NaCl溶液和300 mmol/L 甘露醇溶液处理大豆幼苗，分别在0、3、6、12和24 h取根组织用于检测" GmbHLH130的表达模式。为了检测干旱处理下野生型和转基因拟南芥中干旱胁迫应答相关基因的表达情况，用20% PEG溶液模拟干旱条件处理生长4周的拟南芥，12 h后取叶片用于检测基因的表达水平变化。被检测的基因包括AtCAT（AT1G20630）、AtPOD（AT5G66390）、AtSOD（AT5G51100）、AtNCED3（AT3G14440）、AtP5CS1（AT2G39800）和" AtRD29A（AT5G 52310）。使用RNA提取试剂盒（生工，上海）提取总RNA，使用Nanodrop 2000测定RNA浓度，根据反转录试剂盒（SuperScript Ⅲ" First-Strand Synthesis SuperMix，赛默飞）的操作步骤合成cDNA第一条链作为PCR模板。使用实时荧光定量PCR仪（CFX96，Bio-Rad，美国）进行基因表达量检测。荧光定量PCR体系包括10 μL"" 2×SYBR Green Mix， 正向和反向引物各0.5 μL， cDNA模板1.0 μL，加超纯水至总体积20 μL。PCR仪程序设置为：94 ℃预变性3 min；" 94 ℃变性10 s，60" ℃退火和延伸30 s（40个循环）。以拟南芥" AtActin2（AT3G18780）基因作为内参基因，利用2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。所有样本均包括3个生物重复，本研究使用的定量PCR引物序列见表1。

1.4 启动子元件分析及GUS报告载体构建

通常认为bHLH家族成员通过结合基因启动子上的G-box元件，进而调控靶基因的表达。为了进一步探究大豆GmbHLH130作用的可能机制，从拟南芥数据库（http：//www.arabidopsis.org/index.jsp）检索下载AtCAT、AtPOD、AtSOD、 AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29A基因起始密码子上游1 500 bp的序列，提交到启动子元件分析数据库PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）预测顺式作用元件，分析G-box元件的数量和分布。此外，分别克隆前述基因的启动子片段插入PBI101载体的GUS基因上游，构建GUS载体，然后将GUS载体导入根癌农杆菌GV3101。试验所用引物见表1。

1.5 烟草瞬时转化和GUS活性测定

将含有空载体pFGC5941、重组质粒OE" GmbHLH130或GUS载体的GV3101阳性菌落接种于LB液体培养基，于28" ℃震荡培养至" OD=1.0，离心收集菌体后用10 mmol/L MgCl2溶液（含200 μmol/L" acetosyringone）重悬，然后室温（25 ℃）静置3 h。取生长4周的本氏烟草，使用注射器将重悬液混合液（空载体和GUS载体混合作为对照，OE" GmbHLH130和GUS载体混合为试验组）注射到其叶片中，注射后的烟草正常培养24 h。然后剪取叶片于GUS染色液中，抽真空后于37 ℃暗室静置8 h，叶片用无水乙醇中脱色后观察着色深浅。根据Liu等［20］描述的方法测定GUS活性，提取注射GUS载体的烟草叶片总蛋白与底物4-甲基伞形基-β-将D-葡萄糖醛酸（4-MUG）反应，通过测定荧光强度计算GUS活性。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对GmbHLH130表达的影响

将大豆GmbHLH130与已报道参与植物非生物胁迫调控的其他物种bHLH家族成员进行系统进化分析，结果显示大豆GmbHLH130与拟南芥AtbHLH122和AtbHLH3聚在同一进化分支（图1-A），说明其功能上可能存在相似性。进而使用20% PEG溶液、200 mmol/L NaCl溶液和300 mmol/L 甘露醇溶液处理大豆幼苗，检测" GmbHLH130基因在根中的应答情况，结果显示，其受干旱、盐和渗透胁迫诱导表达均上调，在干旱处理后的上调尤为明显（图1-B）。

2.2 大豆转录因子GmbHLH130对拟南芥耐干旱能力的影响

本研究获得了大豆 GmbHLH130基因过表达的拟南芥纯合子材料（T3代）。比较转基因拟南芥（L1和L2）与野生型（WT）植株的生长表型。结果显示，正常培养时L1、L2与WT植株的表型无明显差异；而停止浇水10 d后，尽管所有植株的生长都受到抑制，但WT的叶片却严重失水、萎蔫，而L1、L2植株的生长状况相对较好，尤其是L2植株的生长受伤害程度较轻（图2-A）。对应的生理指标如单株鲜质量（图2-B）、叶片MDA含量（图2-C）和叶片相对含水量（图2-D）等数据也显示过表达植株在干旱胁迫下表现出相对较好的生长状态。对上述拟南芥材料的离体叶片的失水率进行分析，发现WT叶片的失水率显著高于L1和L2植株叶片（图2-E）。对拟南芥渗透调控物质脯氨酸和可溶性糖含量测定，结果显示，在对照条件下转基因拟南芥L1和L2与野生型拟南芥植株WT的脯氨酸和可溶性糖含量均较低且无明显差异；而干旱处理导致两种物质的含量增加，并且在L1和L2中的含量显著高于WT" （图3）。

2.3 转录因子GmbHLH130对活性氧积累和抗氧化酶活性的影响

利用DAB和NBT染色分别观测拟南芥叶片中H2O2和O-2的积累，结果显示，正常生长的拟南芥叶片中H2O2和O-2的含量均较低，干旱处理导致H2O2和O-2在叶中积累量增加，尤其在WT叶片更明显；在过表达株系L1和L2中的积累量则明显低于WT（图4-A，4-B）。进一步测定了拟南芥叶中H2O2含量，发现正常条件下WT、L1和L2植株叶片中H2O2含量分别为" 2.83、2.90和" 2.81 μmol/g，它们之间无显著差异；干旱处理后，WT叶片H2O2含量显著增加，达到6.30 μmol/g，而L1和L2的H2O2含量显著低于WT，分别为4.81和4.44"" μmol/g（图4-C）。进一步测定拟南芥叶中SOD、POD和CAT酶活性。结果显示，正常生长的拟南芥WT和过表达株系的酶活性无明显差异；干旱处理导致野生型WT和过表达植株的SOD、POD和CAT酶活性均显著增强，且在过表达植株中显著高于WT（图4-D～4-F）。

2.4 转基因拟南芥中干旱响应相关基因的激活

为了深入探究GmbHLH130参与干旱胁迫调控的分子机制，本研究检测了非生物胁迫相关标记基因（AtCAT、AtPOD、AtSOD、 AtNCED3、 AtP5CS1和 AtRD29A）的表达模式。结果显示，所有基因的表达水平在正常条件下的WT、L1和L2植株间均无明显差异；而干旱处理导致基因表达水平均上调，且在过表达株系L1和L2中的上调倍数显著高于WT（图5）。以上结果说明：GmbHLH130异源表达可以通过激活AtCAT、AtPOD、AtSOD、 AtNCED3、 AtP5CS1和 AtRD29A等基因的表达，从而调节植物对干旱条件的适应能力。

2.5 GmbHLH130激活干旱相关基因表达的可能途径

进一步分析拟南芥基因AtCAT、AtPOD、AtSOD、" AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29启动子区的顺式作用元件，发现所有基因启动子区都含有G-box元件。其中PAtCAT上包含4个G-box元件，P AtNCED3含有3个，P AtRD29A含有2个，PAtPOD、PAtsOD和PAtP5CS1都含有1个（图6-A）。构建了" GmbHLH130基因的过表达载体以及AtCAT、AtPOD、AtSOD、" AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29启动子融合GUS的报告载体，" GmbHLH130基因过表达载体分别和报告载体组合共转化烟草叶片，以空载体pFGC5941与报告载体组合转化的叶片作为对照。结果显示， OE GmbHLH130分别与PAtCAT：：GUS、PAtPOD：：GUS、PAtsOD：：GUS、PAtNCED3：：GUS、PAtP5CS1：：GUS和PAtRD29A：：GUS共表达的叶片GUS染色更深，而对照染色较浅（图6-B）。进一步测定烟草叶片的GUS活性，结果显示过表达载体与报告载体共表达的叶片中GUS活性较对照显著增强（图6-C），与GUS染色结果基本一致，说明在烟草叶片中转录因子GmbHLH130结合启动子激活GUS报告基因的表达。

3 讨" 论

植物的非生物胁迫耐受性取决于胁迫关键基因，这些基因表达水平的改变可以提高植物适应各种环境胁迫的能力［21］。尽管bHLH转录因子参与植物非生物胁迫响应的研究已有报道，包括干旱胁迫［22］、盐胁迫［23］和低温胁迫［24］等。然而，大豆bHLH家族成员参与非生物胁迫响应的功能仍需进一步探究。本研究基于湖南科技学院湖南省银杏工程技术研究中心前期研究结果，克隆了受干旱诱导表达上调的bHLH家族基因" GmbHLH130，构建了该基因的过表达载体并通过农杆菌介导的遗传转化获得转基因拟南芥植株。干旱处理下的表型和生理指标显示L1、L2植株的生长状况相对较好，尤其是L2植株受伤害程度较轻。MDA含量反应了脂质过氧化水平，通常用于表示胁迫下的植株损伤程度［19］。本研究结果显示干旱导致所有植株体内MDA含量上升，而过表达植株显著低于WT，尤其L2株系更低，说明过表达植株受伤害较轻。此外，脯氨酸和可溶性糖是植物中重要的渗透剂，被认为是改善植物干旱胁迫导致的不利影响的重要渗透调节物质［25］，" P5CS1基因编码脯氨酸生物合成途径关键限速酶，在干旱胁迫应答过程发挥正调节作用［26］。苦荞FtbHLH3通过上调" P5CS表达水平来增加脯氨酸积累，从而增强植物耐旱性［27］。本研究也得到类似的结果，GmbHLH130异源表达增加了干旱处理后拟南芥叶片" AtP5CS1表达水平和脯氨酸含量，在缓解植株干旱损伤中也发挥重要作用。ABA途径在植物响应和适应干旱胁迫的信号转导中发挥重要作用，可激活下游干旱应答基因的表达；而" NCED3和" RD29A基因是ABA途径关键基因 ［28］。干旱胁迫下，PtrbHLH66蛋白通过激活" DREB1A、" DREB2A、" ERD1、" RD29A和" RD20基因的表达，以ABA依赖途径正调节转基因植株的耐旱性。在本研究中，干旱胁迫下GmbHLH130过表达植株中" AtNCED3和" AtRD29A的表达水平较WT植株显著增加，说明转录因子GmbHLH130调节植物耐旱可能是ABA依赖性的。

植物通常因环境胁迫引起ROS过量积累而受到损伤［29］。而ABA参与干旱胁迫调控可能与其诱导的抗氧化防护系统有关。CAT、POD和SOD基因编码的抗氧化酶在ROS清除过程中发挥功能，SOD能够催化O-2生成H2O2和O2，H2O2则被CAT和POD分解成H2O和O2，减少ROS的积累，从而抑制膜氧化，减少膜系统的氧化损伤。本研究通过3，3′-二氨基联苯胺（DAB）和硝基蓝四唑（NBT）染色分别检测叶片中H2O2和O-2含量，结果显示干旱导致两种主要ROS积累量增加，但是过表达植株叶片中含量较少。为了揭示GmbHLH130过表达植株中氧化损伤减轻的潜在机制，进一步测定了抗氧化酶的活性，即过氧化氢酶（CAT），过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）。发现干旱胁迫下这些酶活性在过表达植株中均显著高于WT，证明" GmbHLH130过表达提高了干旱胁迫下的ROS清除能力，降低了胁迫诱导的氧化损伤。已有报道指出bHLH转录因子通过结合靶基因启动子序列中的E-box或G-box来激活下游基因的表达［6， 13］。本研究通过构建" GmbHLH130基因过表达载体和非生物胁迫应答关键基因AtCAT、AtPOD、AtSOD、" AtNCED3、" AtP5CS1和" AtRD29启动子融合GUS的报告载体，结合烟草叶片瞬时表达和GUS染色以及GUS活性测定，证明GmbHLH130蛋白能够结合到启动子区调控下游靶基因表达，调节植物对干旱胁迫的响应过程。基于本研究结果，初步证明GmbHLH130具有参与干旱胁迫反应的功能。简言之，GmbHLH130蛋白通过结合到干旱应答标记基因启动子区激活其表达，提高渗透调节物质含量、增强抗氧化活性和清除ROS，最终缓解干旱胁迫对植物造成的伤害。本研究为揭示大豆bHLH转录因子参与干旱调控的分子机制提供了重要依据，为作物抗旱育种提供了重要线索。

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Research of Soybean GmbHLH130 Transcription Factor on

Plant Drought Tolerance under Antioxidant Pathway

ZHANG Bin

（Hunan Provincial Engineering Research Center for Ginkgo biloba，Hunan University of

Science and Engineering，Yongzhou" Hunan 425199，China）

Abstract To elucidate the molecular mechanism underlying the involvment of the soybean"" GmbHLH130 gene in regulating plant drought tolerance.We analyzed the phenotype of transgenic Arabidopsis under drought treatment，determined the levels of reactive oxygen species （ROS） and assessed antioxidant enzyme activities.Moreover，we investigated the expression pattern of drought-responsive genes in Arabidopsis and examined the binding activities of the transcription factor GmbHLH130 with the promoters of its downstream genes.The results showed that the overexpression of"" GmbHLH130 gene significantly enhanced the drought tolerance of transgenic Arabidopsis.Under drought treatment，transgenic plant overexpressing"" GmbHLH130 exhibited higher fresh weight and relative water content in their leaves compared to wild-type （WT） plants，while showing lower malondialdehyde （MDA） content and water loss rate.In addition，drought stress led to increased soluble sugar and proline accumulation，elevated antioxidant enzyme activity，and reduced ROS accumulation in the"" GmbHLH130 overexpressing Arabidopsis. Moreover，the expression levels of drought stress responsive genes，including AtCAT，AtPOD，AtSOD，AtNCED3，AtP5CS1 and AtRD29A，were significantly up-regulated in the"" GmbHLH130 overexpressing plants.In conclusion，GmbHLH130 binds with the promoter region of the target gene，activating GUS reporter gene expression.This binding with promoters of drought-responsive genes activates their expression，increases the content of osmoregulatory substances，triggers antioxidant pathway and improves ROS scavenging ability，and eventually alleviates damage of drought stress on transgenic plants.

Key words Soybean;Transcription factor; bHLH; Arabidopsis thalianap; Drought tolerance

Received "2023-01-16 """Returned 2023-05-13

Foundation item The Natural Science Foundation of Hunan Province （No.2022JJ30274）.

First author ZHANG Bin，male，Ph.D，associate professor.Research area：plant developmental biology and plant resistance.E-mail：zhangbin27104@163.com

（责任编辑：郭柏寿 Responsible editor：GUO Baishou）