TmLPCAT转基因高芥酸油菜组培体系的优化

摘 要

转旱金莲TmLPCAT基因油菜的三酰甘油的sn-2位上装配了大量的芥酰基，大大提高了甘蓝型油菜LC的含油量。

旨在优化TmLPCAT转基因高芥酸油菜的组培体系，为高芥酸油菜的进一步分子改良奠定基础。以TmLPCAT转基因高芥酸纯系油菜种子为材料，研究0.1% HgCl2溶液、15%次氯酸钠、15%次氯酸钠（含" 0.1% Triton x-100）3种消毒剂不同消毒时间（5 min、10 min、15 min）的消毒效果，并研究侵染液不同OD值" （0.2～0.4、0.4～0.6、0.6～0.8、0.8～1.0、1.0～1.2）对下胚轴再生的影响，研究不同蔗糖含量" （0 g/L、10 g/L、20 g/L、60 g/L）M4生根培养基对再生苗生根的影响。结果表明，最适合TmLPCAT转基因高芥酸油菜种子的消毒方式是75%乙醇消毒45 s，再用15%次氯酸钠消毒15 min，种子萌发率达到90%；最适宜侵染下胚轴的侵染液OD值为0.4～0.6，转到M3，6 周后发芽率达到48.33%，褐化程度较低；TmLPCAT转基因高芥酸油菜种子再生苗生根的最适蔗糖含量为20 g/L，生根率达到96.65%，并且根的数目较多。表明在原有的油菜下胚轴转化方法基础上，优化了TmLPCAT转基因高芥酸油菜组织培养体系， 提高了下胚轴的出芽率、生根率等。

关键词 高芥酸；组织培养；生根培养；消毒方式

芥酸（C22：1）又名二十二碳-13-烯酸，是一种超长链单元不饱和脂肪酸［1］，前人研究发现种子中芥酸含量较多的植物有十字花科油菜、草地泡沫和海甘兰以及旱金莲科旱金莲等［2］，其中菜籽油中芥酸含量多为20%～50%［3］，旱金莲脂肪酸中芥酸含量则多达66%以上［4］，除此之外，芥酸还以甘油酯的形式存在于某些动物油中。芥酸分子耐高温，防水性和润滑性优异［5］，较短链脂肪酸的氧化聚合速度缓慢，芥酸及其衍生产品是重要的工业原料，在机械、冶金、化工、油漆、纺织、橡胶、医药和制造等众多领域有广泛用途［6］。

中国芥酸年产量约占全世界的1/3［7］，但是由于芥酸对人体健康有危害，使得近年来中国大力培育和推广双低油菜（低芥酸低硫苷）［8］，而工业用高芥酸油菜越来越短缺，中国应抓住这个市场机遇，重视高芥酸油菜品种的培育和种植。种子油90%的成分为三酰甘油，甘油骨架上的sn-1、sn-2和sn-3可以连接脂肪酸形成三酰甘油（图1），但是十字花科植物的三酰甘油骨架中的sn-2位几乎不能结合包括芥酸等超长链脂肪酸［9-10］，大大限制了菜籽油芥酸含量的增加。

旱金莲TmLPCAT基因可以提高甘蓝型油菜LC种子中三酰甘油sn-2位的芥酸含量，可从对照的0.5%提高到接近6%［10］。油菜下胚轴暗转化是油菜遗传转化组织培养的首选方法［11］，目前油菜农杆菌转化体系存在转化效率不高等难题，本试验在前人油菜下胚轴转化方法的基础上，优化TmLPCAT转基因高芥酸油菜纯系种子的遗传体系，以期为高芥酸油菜的分子改良奠定" 基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为西北农林科技大学农学院植物脂质代谢与油料作物基因工程课题组以陕西省杂交油菜中心选育的自交系甘蓝型油菜种子LC（芥酸含量约50%）为背景转化TmLPCAT表达载体之后得到转基因T3代纯系种子，油菜下胚轴暗转化选用PBI121空载体菌株获得再生组培苗。

1.2 试验方法

1.2.1 种子消毒方式 精选TmLPCAT转基因高芥酸油菜种子，去除破碎、带菌、霉变的种子，选取籽粒饱满、大小一致的种子40粒，在超净工作台中将种子置于无菌培养罐中，加入75%的乙醇浸泡45 s，期间不停晃动，使种子充分消毒，倒掉酒精，再用消毒剂分别消毒5 min、10 min、15 min、20 min，消毒剂有0.1%" HgCl2溶液、15%次氯酸钠、15%次氯酸钠（含0.1% Triton x-100）3 种，之后倒掉消毒剂，用无菌水冲洗种子4～5遍，再用无菌滤纸将水分吸干，然后用无菌镊子播种到MO培养基，每种处理重复3次，25" ℃暗培养5 d后统计种子发芽率和污染率。

1.2.2 侵染液OD值 取100 μL -80 ℃保存菌种，加到含有相应抗生素的YEP溶液中，28" ℃培养16 h，将培养好的菌液5 000 r/min离心10 min，弃上清，用相同体积的DM溶液（已加入乙酰丁香酮，工作浓度为100 μmol/L）重悬离心，之后再次用DM溶液（已加入乙酰丁香酮，工作浓度为100 μmol/L）重悬，用分光光度计测OD600，将侵染液的OD值分5组，分别为0.2～0.4、" 0.4～0.6、0.6～0.8、0.8～1.0、1.0～1.2，侵染下胚轴15 min，共培养2 d后转入M2筛选培养基培养3周，再转到M3发芽培养基，6周后统计出芽率。

1.2.3 生根培养基蔗糖含量 探究不同蔗糖含量的M4培养基对再生苗生根的影响，将在M3培养基出芽的再生苗移到M4培养基，M4培养基中的蔗糖含量设置为0 g/L、10 g/L、20 g/L、60 g/L" 4 个水平，每种处理接种30瓶，每瓶1 株，重复3次，21" d后观察组培苗的生根情况。

1.2.4 数据统计与分析 发芽率=（发芽种子数/总播种种子数）×100%

出芽率=（出芽外植体数/总侵染外植体" 数）×100%

褐化率=（褐化外植体数/总外植体数）×100%

褐化程度=下胚轴褐化长度/下胚轴长度

采用Excel 2021进行数据统计，SPSS 25.0软件进行单因素方差分析（Anova），Duncan氏进行多重比较分析。

2 结果与分析

2.1 消毒方式对TmLPCAT转基因高芥酸油菜种子萌发的影响

将经过消毒的TmLPCAT转基因高芥酸种子转到MO培养基，5 d后观察统计发芽率和污染情况。结果如表1所示，3 种消毒剂在消毒5 min时都存在污染情况，20 min时种子虽然无污染，但是发芽率较15 min降低，消毒时间过短和过长都不利于获得较好的消毒结果。用15%的次氯酸钠消毒15 min，种子的发芽率达到90%，并且不存在污染情况，使用含有0.1% Triton x-100的15%次氯酸钠消毒种子，种子的发芽率达" 80.83%，与只使用次氯酸钠差异不显著。综合考虑认为，TmLPCAT转基因高芥酸种子的最佳消毒方式为75%乙醇消毒45 s，再用15%次氯酸钠消毒15" min。

2.2 侵染液OD值对高芥酸油菜下胚轴再生的影响

侵染液OD值是影响转化效率的关键因素，以不同OD值（0.2～0.4、0.4～0.6、0.6～0.8、" 0.8～1.0、1.0～1.25）侵染液，在转入M3培养基6 周之后统计下胚轴出芽率，并观察下胚轴生长状态。结果显示，5 组OD值的下胚轴出芽率分别为23.36%、48.33%、31.67%、18.75%、" 9.17%，当农杆菌侵染液OD值为0.4～0.6时，出芽培养时下胚轴出芽率最高，并且下胚轴褐化程度较轻，随着侵染液OD值的增加，下胚轴的出芽率受到抑制，抗生素难以抑制过多的农杆菌，而导致农杆菌过度生长，严重时甚至导致下胚轴的死亡。就本试验而言，适宜的侵染液OD值为" 0.4～0.6。

2.3 不同蔗糖含量M4培养基对再生苗生根效果的影响

由表3可以看出，再生苗转移到M4生根培养基21 d后，随着M4培养基中蔗糖含量的增加，再生苗的生根率呈现先上升后下降的趋势，在蔗糖含量为10 g/L、20 g/L时再生苗的生根率分别为84.44%、96.65%，没有显著差异，但是在蔗糖含量为20 g/L时，组培苗的再生根数量较多，更有利于后续移出培养瓶，提高转移到土中培养的存活率。因此本试验选择20 g/L作为TmLPCAT转基因高芥酸油菜种子再生苗生根的最适蔗糖含量。

3 结论与讨论

高芥酸菜籽油及其衍生物广泛应用于塑料、机械、医药工业和航天航海中，市场潜力巨大，目前，分子手段已被广泛应用于提升油菜产量和改善农艺性状。双子叶植物油菜对于农杆菌的敏感性大于大多数单子叶植物，油菜理想的转化方式是农杆菌质粒载体转化系统，目前针对油菜的转基因方法主要有：基因枪法、激光微束穿刺法等，农杆菌转化法是目前最常用的油菜转基因手段，转化过程中常用的外植体为下胚轴和叶柄，本试验以下胚轴为转化材料，采用油菜下胚轴暗转化试验（图3），主要原理和步骤为：植物细胞的全能性是植物组织培养开展的理论依据。主要步骤包括创制外植体创面，通过农杆菌侵染维管束细胞，之后通过激素诱导愈伤组织再分化产生再生芽和根，并通过在培养过程中添加筛选剂，减少假阳性植株出现的概率，最后通过鉴定获得阳性植株。

获得无菌培养材料是决定植物组织培养成败的第一步，油菜组培中使用较多的种子消毒剂有次氯酸钠［12］、HgCl2［13-14］等，消毒流程一般为：将油菜种子浸泡在75%的酒精中进行消毒，使用消毒试剂进一步消毒，最后用无菌水将残留的消毒液和75%酒精清洗，以防止对后续的种子生长萌发以及遗传转化带来影响。0.1% HgCl2的消毒效果虽然很好，但是HgCl2有剧毒，会对人体产生毒害，也会严重污染环境。Triton x-100是一种非离子表面活性剂，能够使消毒剂更好地浸润培养材料。本研究发现，在次氯酸钠中加入Triton x-100和单独使用次氯酸钠的效果没有显著差异，15%次氯酸钠消毒15 min可以很好地使TmLPCAT转基因高芥酸油菜种子灭菌。

油菜遗传转化中至关重要的一步是农杆菌介导的油菜下胚轴的侵染，农杆菌侵染液OD值越大代表农杆菌浓度越高［15］，低浓度的农杆菌侵染下胚轴时转化效率低，但是对下胚轴的毒害作用小，高浓度的农杆菌侵染下胚轴时转化效率会提高，但是会对植物组织造成损害，还会出现抗生素无法抑制农杆菌溢出的现象，严重时还会使外植体褐化死亡。徐丹丹等［16］对玉米愈伤组织的组织培养研究发现，在农杆菌的OD值为0.6时，转化率最高，农杆菌的侵染能力最强。本试验研究发现侵染液OD值为0.4～0.6时，转化效率高，并且下胚轴的褐化程度轻，与王博等［17］研究结果一致。

蔗糖在组织培养过程中可以作为碳源为植物生长提供能量，蔗糖具有热易变的性质，培养基经过高温高压灭菌后，蔗糖大部分被分解为更易吸和利用的果糖和葡萄糖，是最好的糖源［18-19］；蔗糖能够调节培养基的渗透压，在山薯组织培养过程中，蔗糖通过参与渗透压调节过程和提供代谢底物来影响山薯组培苗的形态发生途径［20］；蔗糖还与组培苗玻璃化及组织分化诱导有关［21］，薄荷组织培养过程中，越低的蔗糖浓度越快诱导薄荷组织生芽，在蔗糖浓度为1.0%时出芽情况最好，在生根培养过程中则相反，蔗糖浓度越高生根效果越好，蔗糖浓度为3.4%时生根最多并且根最粗。本试验结果显示再生苗的生根率随着蔗糖浓度的增加呈现先上升后下降的趋势，蔗糖含量为" 20 g/L时再生苗的生根效果较好，根的数量较多，有利于提高组培苗后期移栽的成活率。

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Optimization of Tissue Culture System of" TmLPCAT Transgenic High Erucic Acid Rape

LI" Yanan，XING Ming，GUAN Wenqi，HUANG Manting and ZHAO Cuizhu

（College of Agriculture， Northwest Aamp;F" University，Yangling" Shaanxi 712100，China）

Abstract Our research group observed a significant accumulation of erucic acid groups at the sn-2 position of triacylglycerol in transgenic rapeseed expressing the TmLPCAT gene of Tropaeolum majus" leading to a substantial increase in the oil content of Brassica napus LC. This study aims to optimize the tissue culture system for cultivating TmLPCAT transgenic high erucic acid rapeseed， thereby establishing a basis for further molecular enhancements of high erucic acid rapeseed. Using TmLPCAT transgenic high erucic acid pure rape seeds as the experimental material， we investigated the disinfection effects of various solutions， including 0.1% HgCl2， 15% NaClO， and 15% NaClO supplemented with 0.1% Triton x-100， at different disinfection times （5 min， 10 min， 15 min）. Additionally， we examined the impact of different optical density （OD） values （ranging from 0.2 to 1.2） of the infection solution on hypocotyl regeneration. Moreover， we studied the influence of different sucrose concentrations （0 g/L， 10 g/L， 20 g/L， 60 g/L） in the M4 rooting medium on the rooting process of regenerated seedlings. The optimal disinfection method for TmLPCAT transgenic high erucic acid rape seeds involved a 45-second treatment with 75% ethanol followed by a 15-minute treatment with 15% sodium hypochlorite. This protocol resulted in a seed germination rate of 90%. To infect hypocotyls effectively， an infection solution with an optical density （OD） value ranging from 0.4 to 0.6 was found to be most suitable. After transferring to M3 for six weeks， the germination rate reached"" 48.33% with minimal browning. For successful regeneration of TmLPCAT transgenic high erucic acid rape seeds， a suitable sucrose concentration is 20 g/L. This condition leads to a high rooting rate of 96.65% with more roots. Based on the original hypocotyl transformation method of rape， the tissue culture system of TmLPCAT transgenic high erucic acid rape was optimized， and the germination rate and rooting rate of hypocotyl were improved.

Key words High erucic acid; Tissue culture; Rooting culture; Disinfection method

Received "2023-05-09 """Returned 2023-05-29

Foundation item The National Natural Science Foundation of China（No.31901573）.

First author LI Yanan， female，master student. Research area： molecular breeding of rapeseed." E-mail：18317562872@163.com

Corresponding"" author ZHAO Cuizhu， female， associate professor， master" supervisor.Research area：plant lipid metabolism， genetic engineering of oil crops.E-mail：zhaocuizhu2002@163.com

（责任编辑：顾玉兰 Responsible editor：GU Yulan）