文心兰切花无病毒种苗组培快繁生产技术

韩松　王安石　陈施明　周慧　林明光

摘要：针对目前文心兰工厂化育苗过程中种苗带病毒比率偏高的突出问题，笔者于近几年开展了文心兰切花无病毒种苗组培快繁生产技术研究，在取得一定成功经验的基础上总结了一套文心兰无病毒健康种苗工厂化生产的技术体系及其流程，为该切花健康种苗的组培快繁生产提供参考。

关键词：文心兰 切花 无病毒种苗 组织培养 快速繁殖

文心兰是文心兰属（Oncidium）植物总称，目前世界栽培的文心兰切花品种不多，南茜及其变异品种仍为文心兰主栽品种。由于品种间杂交不育和自交不亲和，生产上所需的种苗主要通过组培快繁技术。组织培养技术在克隆亲本植物性状同时，也复制其亲本单株所感染的病毒病。病毒病是文心兰生产上重要病害，国内为害文心兰的病毒主要是建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒，为系统性感染，使兰株生长缓慢，叶片出现条纹、斑块、坏疽或绿色分布不均的嵌纹病斑：花朵上也会出现色泽不均、畸形、或提早凋萎等病斑，严重影响植株生长势、切花产量与品质，且这2种病毒通常在文心兰上复合感染，造成更为严重的为害。文心兰感染病毒初期并不表现明显病症，容易导致栽培者的疏忽，带病毒的种苗在生产上使用极为普遍。据笔者于2014年对海南省各地文心兰种植园采集的299个样品检测结果，发现其兰株总带毒率为28.1%，其中，携带建兰花叶病毒率为13.7%，携带齿唇兰环斑病毒率为17.1%，同时携带2种病毒的携带率为2.3%。种苗带病毒严重影响后续的生长发育、开花品质和鲜切花产量。为解决文心兰工厂化育苗过程中种苗带病毒比率偏高的突出问题，笔者从2012年起开展了文心兰切花无病毒种苗组培快繁生产技术的研究，并于2014年底生产出首批无病毒健康种苗在生产上推广应用。

1.建立无病健康种苗快繁技术体系

1.1无病健康种苗验证制度重要性

世界首次无病健康种苗验证制度源自于1929年荷兰输往美国的郁金香种球，被美方以携带为害性病毒病被拒绝入境。20世纪30年代，荷兰掌据了病毒检测技术后，生产出健康无病毒种球作用繁殖用种源，由此，荷兰政府推动郁金香种球品质验证制度，真正全面增强其郁金香种球竞争力，使其成为全球第一大郁金香输出国。文心兰切花是台湾省最大宗出口鲜切花品种，全省种植面积约200hm2，台湾农委防检局于2002年3月12日公告实施文心兰无病毒种苗验证制度，让符合标准的种苗获得官方验证，提升了其品质与竞争力。应用健康种苗防治系统性病害，因其增产增收增效作用明显已在生产上逐渐应用，我国健康种苗验证制度目前仍以鼓励性质，尚未立法全面强制执行，在文心兰切花生产中宜效仿台湾文心兰验证制度，着手建立适合我国产业需求的种苗验证制度。

1.2无病健康种苗快繁的关键技术

无病毒种苗是未被病毒感染，或经人工处理去除病毒的植物苗株，病毒病是文心兰栽培的重要病害，主要通过带病种苗传染，为了保证在文心兰切花生产中应用无病毒苗株，需要建立主栽品种的无病毒母本园，由它提供亲本外植体繁殖材料。并掌握快速、专一和敏感的病毒检测方法，能快速高度专一地检出存在微量的病原，在短时间内处理多个样品，检测多种病毒，且节约成本。健康种苗应用中，种苗生产速率必须高于栽培后病毒再感染速率，才能取代田间已感病植株，降低田间病原密度，达到延缓病害流行效果，因此种苗能否大量快速生产也是健康种苗应用能否成功关键。以文心兰花梗芽作为外植体进行诱导增殖可在短时间内实现快速繁殖的目的。通常1株生长旺盛的文心兰植株每年可萌生3～6支花梗，每支花梗平均有5个芽，可用于诱导的外植体有15～30个，切除花梗，母株生长不受影响，且外植体采摘和消毒方便。因此，花梗芽组培快繁技术对无病毒优良种苗快繁作用非常重要。

此外，必须完全掌握病毒传播途径及可能污染源传播方式。为害文心兰鲜切花生产的2种重要病毒CyMV和ORSV经由机械性伤口入侵植物体内，因其在细胞外可存活极长时间，甚至长达10年之久，为稳定性极高的传性病毒，容易污染栽培环境、器具与人员，组织培养或田间栽培管理过程中，所有可能造成表面伤口的操作，包括接种、换盆、修剪、切花甚至植株叶片间摩擦，都可能是病毒入侵感染的途径。在无病毒健康种苗繁殖过程，确保繁殖后代种苗不会再次受到病原感染，以确保健康种苗品质。同时在无病健康种苗应用到田间时，采取预防病毒传染的栽培措施，延缓或避免健康种苗受病毒感染，充分发挥健康种苗作用。

1.3无病健康种苗组培快繁技术流程

无病健康种苗组培快繁技术体系包括无病毒母本园建立，病毒检测技术和组培快繁技术3个部分，通过选择优良性状的亲本兰株，经过病毒检测程序，测定无病毒感染后，进行组织培养快繁，生产大量组培分生苗。无病毒健康种苗繁殖流程详见图1。

2.无病毒母本园建立

2.1母本园的设施条件

母本园栽培种植适宜在具有遮雨、防虫（防虫网为100目）、移动式遮阳网和水帘风机或空调调节适合植株生长的隔离环境中。文心兰最适宜生长的温度为25～30℃。一般只能接受冬季的阳光直射，夏季遮光60%～70%，其他季节遮光40%。

2.2无病毒繁殖母株的保存

无病毒繁殖母株是从大田采集优良性状或变异单株，经检测确定不带有CyMV和ORSV 2种病毒后作为繁殖母株进行保存。母本园内的所有无病毒繁殖母株应独立编号，植株间不得相互接触。若有特殊情况必须将未经病毒检定之植株移入母本园，须单独编号且不得与其他植株接触，应尽速进行病毒检测，无病毒感染者方准予长期留置母本园内保存。栽培期间若发现可疑植株应立即进行病毒检测，检测结果如确定为病毒感染者应立即将植株移出保存园，且原置放位置应进行消毒预防措施，方能再放置其他母株。移出过程中需绝对避免碰触其他植株，最好以报纸包裹后再移动之。每半年进行1次例行母株病毒检定，以掌握确实感染状态。

2.3母本园的管理措施

母本园应严格管控人员出入，并严禁任何人为接触植株造成感染机会。人员在对母株进行操作时，使用的工具应经消毒处理，单株单剪，随株更换，不得重复使用。若有碰触植株时，应配戴抽换式手套，且必须随植株更换。母本园内应随时保持整洁，植株残体必须随时清除，不得随意遗弃。所使用盆钵、介质、器具及花梗固定用器材等应采用全新资材。应设置管理纪录簿，仔细记录母本编号、移入日期、存放位置及病虫害防治措施等。

2.4母本园的消毒措施

场地及表面消毒以0.5%漂白水定期喷湿表面擦拭。人体常接触部位，如门把、电器开关、浇水喷头手把、扫帚手把等也应定期以0.5%漂白水擦拭。使用器材和工具根据实际情况，可参考张清安（1995）的4种消毒方法，择一采用。一是干热消毒法，利用烘箱在180℃至少维持1 h；二是湿热消毒法，以沸水煮沸至少15 min；三是火焰消毒法，将工具上接触过植物汁液的部位以火焰烧烤至少10～20 s；四是化学药品消毒法，以3%氢氧化纳或磷酸三钠溶液浸渍至少1 min。

3.文心兰病毒检测技术

3.1采样方法

取样数量为大田栽培植物或组培苗抽取全部有症状疑似病株，无症状植株按其总数的3%～5%随机抽样，最低抽样50株，不够50株的全部抽取；组培母瓶抽取全部样品。取样部位为疑似病株，取有明显症状叶片，无症状植株，取完全展开的淡绿期叶片。样品采集时，用灭菌的手术剪剪取叶片1片置于封口袋中-20℃保存，最多存放7 d。

3.2繁殖母株的病毒检测

从田间收集或引种的具有优良性状的繁殖母株样品采用双抗体夹心法（DAS-ELISA）按照刘福秀等（2013）的方法检测CymMV和ORSV。每个样品设置2个重复。读取405 nm的吸收值，参照Satu1a等（19860的方法，吸收值在阴性对照的2倍以上视为阳性。2种病毒的检测结果均为阴性的样品进入母本园待用，任一病毒检测结果出现阳性均淘汰。此检测方法快速、经济，可准确检测此2种病毒，能在很大程度上保证用于繁殖的母本植株不携带病毒。

3.3组培母瓶的病毒检测

采用双重反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测技术，参照刘福秀等（2014）的方法检测组培母瓶的带毒情况。扩增结果出现675 bp条带视为CymMV阳性，出现524 bp条带视为ORSV阳性。2种病毒的检测结果均为阴性的组培瓶进入下一步扩繁操作，任一病毒检测结果出现阳性均淘汰。该检测技术可同时检测2种病毒，其敏感度约为ELISA的1000倍以上，在阳性样品总RNA稀释10000倍后仍能检测出病毒信号，且对部分经ELISA测定为阴性的样品中仍可顺利检测到病毒信号。可保证生产出来的种苗不携带这2种病毒。

4.花梗芽无病毒组培快繁技术

4.1无病毒组培母瓶培养

组培母瓶培养根据王安石（2015）研究，以外形呈笋状，花苞和分叉始露出花梗苞片，高约70cm和中部节位的花梗上的芽为最适宜外植体；用0.1%升汞消毒处理花梗芽的适宜时间为12 min；1/2MS+6-BA 2.0 mg/L+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2mg/L为花梗芽最佳初代诱导培养基。以35～40 d为1个诱导培养周期，经1～3次转接后约95%的花梗芽转化为营养芽，把经过3次诱导所有获得的营养芽，经RT-PCR病毒检测技术确认无病毒后，以无病毒组培母瓶进行集中增殖培养。

4.2增殖培养

继代培养以6.BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L为最佳激素组合；以温度25℃和光照强度2500 Lx（光照时间10-12 h/d）的培养条件最为理想。以继代培养基为MS+6.BA 3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+椰子水100 mL/L。壮苗培养培养基为MS+香蕉浆50 g/L，生根培养基为1/2MS+NAA 0.5 mg/L+香蕉浆50 g/L。丛生芽培养以双芽或三芽为单位个体进行转接，每45 d为1个循环周期继代转接1次，原球茎培养25～30 d转接1次，连续转接不超过12代。株高在3.0 cm以下的小苗进行壮苗培养，壮苗培养周期为50～60 d。经壮苗培养株高达3.0 cm以上，有5～6片叶的小苗切分成独立的植株进行生根培养，转入12 cm×15 cm聚丙烯组培袋，每袋放置10株小苗，转入500 mL玻璃瓶每瓶放置25株。

4.3出圃质量标准

经生根培养60 d后，达到以下质量标准时作为合格组培苗即可出厂：一是植株生长健壮、挺直，叶片舒展、从基部往上呈互生状，有层次感，无玻璃化，无黄叶；二是培养基及材料无真菌和细菌污染；三是苗高8～12 cm，苗粗0.4～0.59 cm，叶片数7片以上，根5根以上。合格组培苗经健化培养240 d的生长情况见图2。