我国北美红杉组织培养研究进展

尹丽莎　辛雅萱　李斌等

摘要：北关红杉主要分布于我国华东、西南地区，是一种速生珍贵大径级用材树种和木材工业原料。从北美红杉外植体的选择、消毒、腋芽的诱导、增殖培养以及生根、生长调节物质使用等方面，阐述了我国红杉组织培养技术的研究进展，以期为促进北美红杉产业的发展提供参考。

关键词：北美红杉；组织培养；研究进展

植物组织（离体）培养是指利用植物离体器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实）或者植物组织（如分生组织、表皮组织、薄壁组织等）为培养对象，通过对材料诱导，使其产生愈伤组织或者芽等植物器官，进一步发育成完整植株的技术。植物体的每一个具有完整细胞核的细胞（不管性细胞还是体细胞）都含有该物种的全部遗传信息，在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成1棵完整的植株。

植物离体快速繁殖不仅保持了常规营养繁殖的全部优点，还独具以下优点：首先，遗传基础一致，能保持母体优良性状，可以一次性获得大量基因型相同、表现型一致的植株。其次，利用组织培养法进行繁殖周期短、繁殖快，节省空间，繁殖系数高。离体下的培养，扩繁倍数的提高，有利于缩短一个新品种的选育到推广所需的时间。例如：利用植物某一个极微的组织或器官进行离体培养，在短时间内就能产生数百万以上植株，如此快的繁殖速度是其他传统无性繁殖方法所不能比拟的。由于在人工控制条件下进行，根据不同植物、不同离体部位的要求提供不同的培养条件，不受地区和气候的影响，无季节之分，能进行周年生产。最后，通过组织培养可以获得无毒苗木无性系。无毒苗有利于恢复原品种的性能和增加产量等。由于植物栽培过程中易感染病毒，从而导致生产力降低、品种退化，严重时导致植株死亡，对生产者造成难以估量的损失。利用植物脱毒技术可去除植物病毒，从而恢复植株原有种性，这是其他营养繁殖所不能达到的。

北美红杉（Sequoia sempervirens Endll）又称美国红杉，起源于美国加利福尼亚州，现广泛分布于我国华东、西南各省，其适应性强，在各引种点都能较好地生长，广泛应用于造林、城市绿化，是我国华东、西南地区的重要速生用材树种。红杉生长神速、木材材积量高、分布广阻捌，木材材质韧性好、结构均匀，纹理清晰、易于加工、可用于家具、建筑、纸浆等用材，具有广泛的市场发展前景。红杉的繁殖方式以传统的种子播种繁育为主，此方式成本高，耗时耗力，且出苗质量不高，高矮不一致，分化现象严重。当代生物技术不仅能有效地克服传统育苗的不足，而且培育出的苗木具有母本的优良特征，是取得优质壮苗的有效方法。

1外植体选择

植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段，如茎尖、茎段、皮层及维管组织、髓细胞、表皮、块茎的贮藏薄壁细胞、花瓣、根、叶、子叶、鳞茎、胚珠和花药等为材料，称为外植体。外植体的选取是否恰当对植物组织离体快繁起着至关重要的作用。

1.1取材部位

由于植物细胞具有全能性，因此任何组织或器官在条件适应的情况下均可再生成完整植株。但不同种类的植物以及同一植物的不同器官对外界诱导的条件反应敏感程度是不同的。取材时应考虑外材再生能力强、遗传稳定性好、来源丰富、容易灭菌等方面，对于大多数植物来说，茎尖是最佳的外材，其形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，是获得无病毒苗的重要途径。通常年幼组织比年老组织有较高的形态发生能力，容易培养，有较大的再生能力。

1.2取材时间

一般选择植株生长旺季取材，若在生长衰老期或已进入休眠期取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，连续晴朗天气取材，避免阴雨天。材料太大，易污染；材料太小，难于成活；材料大小适中，一般为2～3cm。

2外植体的消毒

植物组织培养能否顺利进行，取决于外植体的灭菌、消毒环节。不同取材部位对灭菌剂的种类、浓度以及处理时间长短有所不同，因此视材料敏感情况而定。在北美红杉组培试验研究中，最常用的消毒试剂是升汞。首先，把取回来的样放在流水下冲洗30min以上，可酌量加入洗涤剂；其次，剪下所需材料用75%的无水乙醇喷洒植株表面2～3s，倒入0.1%升汞溶液处理20min；最后，用无菌水涮洗4～5次，转入培养基，该消毒方法效果显著，污染率5%，出苗率90%。常见的消毒剂有次氯酸钠、次氯酸钙、漂白粉、氯化汞、酒精、过氧化氢、溴水、硝酸银、抗菌素等。外植体的消毒是整个组培试验中的重中之重，消毒是否彻底关系到后续的进行，不同来源及不同老化程度的外植体对消毒试剂的选择不同。

3离体培养技术

培养基的筛选是组织培养的必经过程。培养基不仅为外植体创造内部小环境，而且为植物提供基本营养物质。培养基的选择不同以及所加入植物激素种类及浓度不同，对外植体腋芽启动、增殖、分化培养及壮苗生根产生的效果不同。在快繁过程中，人们应根据不同的需求来选择不同培养基种类、激素浓度。

3.1腋芽诱导

在红杉组培快繁试验中，利用茎段为外植体获取芽是最快最直接最有效的途径之一。红杉诱导芽比较容易，对植物激素的选择不专一。同一激素不同浓度以及同一浓度不同激素种类的搭配使用对芽的诱导生长有不同的影响。在红杉腋芽诱导过程中，MS为常用的培养基，6-BA和KT为主要的生长调节物质，6-BA、KT均能促进培养体上不定芽的分化和形成，在基本培养基上单独使用1.0～2.0mg/L的6-BA可成功诱导新生芽发生；将6-BA与KT配合使用则需适当降低6-BA的使用浓度，且KT浓度应以较低（0.5～1.5mg，L）为宜。另外，不同的季节取材对不定芽的诱导也具有一定影响。

3.2继代增殖培养

北美红杉增殖培养中，出苗率、出苗质量、繁殖系数的高低直接影响到组织培养的经济效益，因此筛选增殖培养基显得十分重要。6-BA、KT和NAA是北美红杉增殖培养中常用的植物生长调节剂。经研究发现，附加0.05～0.15mg/L6-BA、0.05～0.1mg/LKT和0.1～0.2mg/LNAA的MS培养基均可满足北美红杉不同种源、不同无性系的增殖培养。通过对3个优良无性系品种进行增殖培养研究，进一步证明了MS+0.15mg/L6-BA+0.1 mg/LKT+0.1 mg/LNAA具有较好的增殖效果。在红杉增殖培养中，除NAA外，将生长调节物质IBA、2，4-D和Zt配合使用，也具有较好的增殖效果。本实验中利用茎段不带芽为起始外植体采用MS+6-BA2.0mg/L+KT2.0mg/L进行分化培养，成功地诱导愈伤组织出芽，该研究发现1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L也比较适合红杉不定芽的增殖培养。

3.3生根与壮苗

根据研究表明，添加0.4～2.5mg/LNAA（萘乙酸）和2.0～3.5mg/LIBA（吲哚丁酸）可诱导北美红杉生根，根的诱导与芽相比较困难，还有待进一步的研究。利用红杉徒长枝幼苗生根培养45d后，发现1/4MS培养基中芽的基部首先有乳白色的小根长出，随后在其他不同无机盐浓度培养基中陆续也有根长出。2个月后统计发现，红杉生根明显受无机盐浓度的影响，生根率顺序为：I/4MS>1/2MS>MS，其中发现1/4MS培养基中生根数量较多，颜色鲜嫩。1/2MS培养基中根系相对较长，但苗的生长情况不好，基部出现少量的愈伤、茎秆出现枯黄现象。MS培养基生根率较低，基部愈伤较严重且枯顶、枯黄现象较严重。结果表明，不同无机盐浓度培养基，不仅影响根的分化而且影响植株的健康生长状况。基因型也制约着根系的形成，不同无性系间根的诱导也明显存在不同的差异。外植体的选择对生根的影响也很重要，由于不同的取材部位其内源抑制物的积累不同，制约着植物生长素的吸收。

壮苗与生根对后期的移栽、炼苗以及提高苗木质量十分关键，而影响生根的因素较多，生根环节是红杉组织培养中的难点，虽然前人已在生根方面做了大量的研究，但由于不同无性系间基因型不同，外植体的内源抑制物的积累不同等原因，至今尚未研究出最佳生根配方，因此仍需进一步的研究。

4问题与展望

（1）目前北美红杉组织培养技术已在我国取得了良好的进展，且在一些省份已建立了红杉组织培养体系并用于生产化。但由于红杉不是我国特有的树种，在取材上范围过于局限，不具有代表陛。因此在今后的研究中，应大量引种栽培，对全国范围不同地区不同优良无性系间取材进行离体培养，建立具有稳定性高、更具广谱性的红杉快繁体系。

（2）红杉外植体的消毒、灭菌还需进一步的研究。在灭菌剂的种类、浓度以及处理时间上相关研究报道较少。目前较常用的是采用75%的乙醇和0.1%升汞二步法灭菌。研究发现，乙醇的处理时间对茎段腋芽的诱导起着至关重要作用。在红杉组织培养中，腋芽的诱导是获取不定芽的主要途径，目前在灭菌剂种类选择上单一，因此应加大灭菌技术方面的研究。

（3）在红杉增殖培养过程中，出现枯顶现象影响着组织培养的后续进行。目前红杉枯顶现象尚未解决，有关报道较少见。