菊苣肉质根膨大与其生理及基因表达变化初步研究

摘 要 初步探究菊苣肉质根膨大发育进程的农艺性状、生理指标和基因表达变化，以期进一步探讨肉质根发育的生理和分子调控机理。以盆栽根用菊苣‘Hera’和叶用菊苣‘将军’为材料，获取8个不同发育时期的肉质根样品，对糖和内源激素进行定量分析，并对转录因子基因进行qPCR表达量分析。结果表明，根用菊苣根径、根干质量、根冠比和根库活性均大于叶用菊苣。‘Hera’肉质根果糖、葡萄糖和蔗糖含量分别在S2、S3和S4时期最高，且葡萄糖、果糖含量在各时期均高于‘将军’。‘Hera’肉质根生长素IAA、细胞分裂素CTK和赤霉素GA含量均呈现膨大前期高、中期低、后期较高的态势，转录因子基因 CiMYB73、 CiERF13、 CiNAC017、 CibZIP53均在S2时期（播种后38 d）呈现高表达。根用菊苣与叶用菊苣农艺性状差异显著，糖和激素可能协同作用于肉质根的膨大发育，播种后38 d可能为菊苣肉质根膨大发育的关键时期。研究结果对后续菊苣肉质根的遗传调控研究、基因工程改良等有一定的参考价值。

关键词 菊苣；肉质根膨大；糖；内源激素；转录因子

菊苣（Cichorium intybus L.）是菊科菊苣属多年生草本植物，根可作药用，地上部常作饲草用；肉质根是菊苣的贮藏器官，是提取菊粉（inulin）的主要原材料。菊粉即菊糖型果聚糖（fructan），是以果糖、葡萄糖和蔗糖为底物在果糖基转移酶催化下合成的多糖，在食品领域广泛应用［1-4］。菊苣在营养生长季，肉质根形成经历种子根、膨大期和衰老期3个阶段，其中膨大期占据生长期多数时间；衰老期表现为地上部逐渐枯萎冻死，此时采挖肉质根加以利用，或者保留肉质根在田间越冬［5-6］。肉质根是菊苣的主要经济器官，因此有必要对其发育生理和遗传进行深入的研究。

根茎类作物贮藏器官种类多样，马铃薯的块茎、甘薯的块根、萝卜的肉质根、莲藕的根状茎，其组织结构差异巨大，而膨大发育是其共同特征［7］。菊苣肉质根膨大的形态与甜菜非常相似，二者肉质根横剖面表现为不同的次生生长结构；甜菜积累蔗糖，而菊苣积累果聚糖［8］。从播种到收获贮藏器官，膨大过程受发育和环境的综合影响，其遗传调控机理复杂。已有研究表明，糖和内源激素在根茎类作物的贮藏器官发育过程中产生重要作用［9-12］，并且与转录因子形成复杂的调控网络，作用于生长发育［13-18］。菊苣肉质根发育过程糖分变化的研究较多［19-21］，而激素和转录因子对发育影响的研究较少［22-24］。转录组学研究表明，菊苣肉质根不同发育阶段代谢产物和基因的差异表达对菊苣主根膨大至关重要；菊苣肉质根发育调控网络复杂，涉及转录调控、激素信号转导、碳水化合物代谢、细胞壁代谢以及木质素生物合成等通路［25］。

本研究选用肉质根发育形态差异显著的根用菊苣和叶用菊苣品种为试验材料，探索肉质根膨大过程中糖含量和内源激素的变化规律，结合相关转录因子基因的表达量变化，进一步探讨肉质根发育的生理和分子调控机理，为基因工程改良菊苣肉质根性状提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取菊苣主栽品种‘Hera’（根用型）和‘Commander’（‘将军’，简写Cmdr）（叶用型），种子分别来源于比利时CHICOLINE和美国百绿公司。2022年初，在26.5 L花盆中装填栽培基质，其中含草炭∶ 蛭石∶珍珠岩=3∶1∶1（体积比），以及 NPK 复合肥（云天化，总养分≥48%）" 0.2 g/L，生物有机肥（中农宝易，有机质≥45%）" 3 g/L；浇透水后播种，每品种9盆，每盆播种20粒种子，置于温室大棚培育植株，出苗后间至每盆10株。试验大棚位于青海省西宁市城北区青海大学农林科学院园艺实训基地，‘将军’和‘Hera’播种时间分别为1月1日和1月31日，夜间和阴天棉被保温，生育期保证水肥充足供应。

1.2 农艺性状测定

‘Hera’和‘将军’分别在播种后25 d（DAS=25 d，Days after sowing）和55 d开始第一时期（S1）的农艺性状调查和根样品收集，此后每隔2周（因疫情封控或间隔更长时间）开展共计 8 个不同生长时期的调查取样，即 S1～S8。

挖取盆栽单株洗净，测定农艺性状包括根长（RL， Root length，cm）、根径（RD， Root diameter，cm）、叶鲜质量（LFW， Leaf fresh mass，g）、根鲜质量（RFW， Root fresh mass，g），6次单株重复；并立即从每个单株的肉质根分取一部分用液氮速冻，-80 ℃冰箱冻存，以待测定内源激素和基因表达量。随后，根、叶混合样品带回实验室，烘干后测定叶干物质含量（%）和根干物质含量（%）；烘干样品磨粉用于测定糖含量。叶干质量（LDW， Leaf dry mass，g）、根干质量（RDW， Root dry mass，g）为鲜质量和干物质含量乘积，根冠比（root/shoot ratio， R/S）为RDW/LDW计算。库活性计算按照Warren-Wilson所提出的公式［26］，库活性=（lnw2-lnw1）/T，其中w1、w2分别为肉质根不同发育阶段始、末期的干质量（g），T为不同阶段所持续时间（d），即库活性为单位干质量单位时间内所增加的干物质质量（g）。

1.3 生理指标测定

肉质根含糖量包括葡萄糖、果糖和蔗糖含量的测定，方法见Solarbio公司（www.solarbio.com）试剂盒说明书BC2505、BC2455和BC2465；干粉样品称取量分别为20 mg、50 mg和20 mg，每样品重复3次。肉质根内源激素测定采用Elisa酶联免疫吸附法，该方法具有高灵敏性，操作简便，已被大量研究采纳［27］。所用试剂盒来自酶免公司（www.mmbio.cn），型号分别为吲哚乙酸（IAA， MM-095302）、细胞分裂素（CTK， MM-069202）、赤霉素（GA， MM-012502），具体操作按照试剂盒提供的说明书进行。根据酶联免疫反应Elisa显色原理，对肉质根匀浆液（肉质根冻存鲜样1∶磷酸缓冲液9，质量比）离心上清液样品、标准物梯度稀释溶液和空白对照，在酶标仪上以450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），依据标准曲线进行定量，重复3次。标准曲线分别为：IAA，y=0.019 1x （R2=0.995 4）；CTK，" y=0.017 4x （R2=0.997 5）；GA，y=0.001 2x （R2=0.997 9），x为激素浓度，y为吸光度。

1.4 基因表达量检测

前期工作已筛选出差异表达转录因子（TFs， transcription factors）［25］，本研究对其中6个转录因子（CiMYB73、CiMYB308、CiERF13、CibHLH13、CiNAC017、CibZIP53）进行荧光定量PCR（qPCR）检测，确定其在不同发育阶段的表达水平。采用天根公司（Tiangen Beijing）多糖多酚RNA提取试剂盒（DP452）提取菊苣肉质根总RNA，并进行质量检测（琼脂糖凝胶电泳），保证RNA样品的完整性。cDNA合成采用逆转录-PCR方法将RNA转换为cDNA（试剂盒KR116，Tiangen），合成反应的模版RNA量为1 μg，逆转录体积为20 μL，反应程序为42 ℃ 15 min，95 ℃"" 3 min。qPCR检测基因相对表达量，扩增反应在Roche LightCycler 480Ⅱ中进行（条件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环），使用SuperReal PreMix Color（SYBR Green）试剂盒（Tiangen）。所有反应一式三份进行，并应用方程（比率=2-△△CT）来计算所选单基因的相对表达水平，CiEF（延伸因子1-α）作为内参基因其提供内部控制［28］。用来PCR扩增的引物序列用PP design 6软件设计（表1），引物由赛斯克生物公司（西宁）合成。

1.5 数据分析

各时期性状指标数据采用Excel 2013整理，平均值差异显著性分析采用SPSS 26.0软件，变化趋势点线图作图采用Origin 2022软件，误差为标准偏差。依据Ct值计算以内参基因EF为样品间控制的目的基因相对表达倍数，以表达量最高者为1.0进行换算调整并作图，误差为3次重复的标准误差。

2 结果与分析

2.1 菊苣肉质根膨大过程农艺性状变化

单株农艺性状调查结果表明，根用菊苣‘Hera’和叶用菊苣‘将军’形态差异明显，‘Hera’肉质根表现为明显的膨大，根表面光滑，侧根少，‘将军’正好相反；‘Hera’叶色深绿，而‘将军’叶色浅绿；‘将军’叶片质地更为柔软（图1）。‘Hera’根长小于‘将军’，二者最长分别为27.78 cm和" 35.38 cm；‘Hera’根长在播种后53 d（DAS=53 d，即S3时期）之前快速增加，此后根长缓慢增加（图2-A）。‘Hera’根径由0.65 cm（DAS=25 d，即S1时期）增大至4.88 cm（DAS=134 d，即S7时期），其中S7、S8时期根径显著高于S1～S4时期（Plt;" 0.05），而与S5、S6时期差异不显著（图2-B）。‘Hera’肉质根干质量呈现先慢后快增加趋势，在S8时期有显著降低（Plt;0.05）（图2-C）。两个品种的根冠比呈上升-下降趋势，在S6～S8时期，‘Hera’ 根冠比（干质量）分别达到5.27、15.79和7.70，而‘将军’根冠比在S6时期最大为3.11（表2）。菊苣肉质根膨大过程中库活性呈总体下降趋势，‘Hera’和‘将军’最大分别为"" 0.138 0 g/（g·d）和0.133 0 g/（g·d），分别出现在S2时期和S1时期（表2）。

上述结果表明，在菊苣肉质根膨大发育阶段，‘Hera’品种在根径、根干质量、根冠比和库活性上均大于‘将军’，这一结果契合两个品种的不同类型和用途。为描述简便，将根用菊苣‘Hera’肉质根膨大发育期划分为3个阶段：膨大前期（S1～S3，DAS 25～53 d）即根长增加阶段、膨大中期（S3～S6，DAS 53～120 d）即集中膨大期、膨大后期（S6～S8，DAS 120～150 d）即肉质根衰老期。在衰老期，肉质根库活性明显降低，叶片数先减再增，说明肉质根开始往地上部输送营养，供新叶再生所用（大棚环境），肉质根已达到完熟状态。

2.2 肉质根形成过程中糖含量变化

‘Hera’品种肉质根发育时期不同，葡萄糖的含量也不同，总体呈现升-降-升-降的双峰变化趋势；发育时期S3葡萄糖含量最高为19.76 mg/g（以干物质计），是S4最低4.88 mg/g的" 4.0倍，显著高于其他发育时期（Plt;0.05）（图2-D）。不同发育时期‘Hera’肉质根果糖含量在41.47～67.07 mg/g，在S1～S2时期显著高于S4～S8时期（Plt;0.05），总体表现为膨大前期高于膨大中期和后期（图2-E）。‘Hera’肉质根蔗糖含量为25.32～40.72 mg/g，呈现先升后降的趋势，在S4发育时期最高，显著高于S1、S6、S7和S8时期（Plt;0.05），与S2、S3、S5时期差异不显著（Pgt;0.05）（图2-F）。由此可见，菊苣肉质根膨大过程中，果糖含量最高，其次是蔗糖；葡萄糖丰度最低，但是含量变化最为剧烈。

进一步研究发现，‘将军’肉质根膨大过程中葡萄糖和果糖含量小于‘Hera’，而变化趋势却与‘Hera’相似，二者肉质根中葡萄糖含量都在S4时期最低。‘将军’菊苣膨大期S1～S2肉质根中，蔗糖含量显著高于后期S6～S8，且高于‘Hera’菊苣S3～S4时期的蔗糖含量；由于‘将军’播种期早于‘Hera’30 d，其S1时期之前的蔗糖含量未知。‘Hera’肉质根中S1～S4时期蔗糖含量增加，可能与膨大前期叶面积增加、叶片光合能力较强有关。

2.3 肉质根膨大过程内源激素变化

‘Hera’肉质根样品IAA、CTK和GA 3种激素的测定结果见图3，其中IAA含量表现为中期低、前期和后期高，S1时期最高为0.497 μg/g（鲜质量样品），显著高于S4和S5时期（Plt;0.05）；CTK含量在0.296～0.444 μg/g，各发育时期无显著差异（图3-A）。GA含量在2.405～5.446 ng/g，呈中期低、前期和后期高的态势，S1～S2时期显著高于S4～S6时期（Plt;0.05）（图3-B）。

2.4 肉质根形成过程中转录因子基因表达量" 变化

本研究6个转录因子基因中，" CiERF13基因为乙烯响应因子基因，其相对表达量在S2时期（DAS=38 d）最高，S1时期稍低于S2；并在生长中期骤降，而后期稍有回升（图4）。这说明早期的肉质根发育需要乙烯响应因子的参与，而中期集中膨大时" CiERF13的功能相对次要。两个MYB类转录因子基因， CiMYB73的相对表达量在S2时期最高，大大高于S1时期（图4），推测其表达在S2时期被激活，可能作用于启动肉质根膨大发育进程； CiMYB308的相对表达量在S1时期最高，但在S2时期相对较低，S3时期又恢复高表达，随后维持在较低的表达水平（图4）。推测 CiMYB308与 CiMYB73两个MYB类转录因子可能存在竞争表达关系；更多的MYB类转录因子的表达量深入挖掘可能有助于解析肉质根膨大的调控机理。其他转录因子， CiNAC017、 CibZIP53都在S2时期呈现最高表达， CibHLH13在S2时期呈现较高表达量（图4）。

综上所述，结合膨大发育的农艺性状、糖和激素生理指标以及转录因子相对表达量的变化，推测盆栽根用菊苣‘Hera’在S2时期，即播种后" 38 d，单株叶片数约10片、根径约1 cm、根干物质质量约2 g时期为其肉质根膨大的关键时期；此时多个转录因子处于最高表达状态，对于激活基因表达、加速合成蛋白酶类和代谢产物具有正向调控的作用。

3 讨" 论

3.1 菊苣肉质根膨大发育农艺性状表现

本研究比较了根用菊苣和叶用菊苣形态和农艺性状表现，发现二者存在显著差异，并将根用菊苣‘Hera’的肉质根膨大过程划分为3个阶段，为描述菊苣肉质根发育进程提供了依据。据报道，菊苣根系发育周期的第一年可分为3个阶段：①种子根时期，包括细长主根及其生成的侧根；②膨大期，通过径向生长形成膨大主根（即增粗）；③衰老阶段，伴随着果聚糖停止积累［6］。本研究中，‘Hera’菊苣发育S1时期具备种子根的特征，S2时期可能是向膨大期转变的关键时期，最终形成与叶用菊苣‘将军’截然不同的形态。

菊苣种子细小，千粒质量仅为约1.5 g，因此早期营养生长需要构建地上部，苗期较长，为肉质根集中膨大做准备。采用盆栽方式较易实现栽培条件的一致性控制，基质土松软利于根系充分发育，以及方便进行样品获取。菊苣为异花授粉植物，品种内个体异质性高，造成单株生长发育指标变异性较大。盆栽试验中，‘Hera’因出苗慢、数量少而进行了补播，故其播种期晚于‘将军’30 d，而此时‘将军’已进入4～6叶期，具体分析时需考虑‘将军’提前进入膨大期这一事实。总之，根用菊苣和叶用菊苣肉质根膨大性状存在巨大差异，是研究肉质根发育的良好试验材料。

3.2 糖分变化与肉质根膨大发育的关系

糖分是菊苣肉质根中主要的营养成分。蔗糖由叶片光合作用合成并向地下部转运，本研究发现盆栽菊苣‘Hera’肉质根发育S1时期蔗糖含量低而果糖含量高、葡萄糖含量低，可能与该时期蔗糖分解为葡萄糖和果糖，其中葡萄糖更多用于肉质根形态构建有关。S2～S4时期蔗糖含量高于S5～S6，一方面与S2～S4时期叶片的光合能力增强有关；另一方面，S5～S6时期肉质根的急速膨大消耗大量营养物质用于形态构建，而短时间内没有足够的营养物质填充到组织中。尽管后期肉质根干物质含量增加，但这3种糖的含量并未显著增加，总含量加起来在100 mg/g左右，占总干质量比例约10%，说明干物质的积累另有其他物质，主要包括果聚糖、氨基酸、脂肪等初生代谢产物［25］。

本研究表明，根用菊苣‘Hera’肉质根干物质的积累速度和积累量高于‘将军’，其原因可能在于‘Hera’肉质根维持了较高的葡萄糖、果糖浓度，且蔗糖的浓度较低，促进了葡萄糖和果糖合成蔗糖；而蔗糖又进一步作为底物，在果聚糖合成酶1-SST的作用下，驱动了果聚糖（蔗果三糖）的合成［29］。葡萄糖、果糖和蔗糖是合成多糖（菊苣中为果聚糖，即菊粉）和其他糖分代谢的起始糖，因此探讨菊苣肉质根营养器官发育过程中上述3种糖含量的变化，有利于认识根用菊苣果聚糖积累和糖代谢的特点［19］。

3.3 内源激素对肉质根膨大发育的调控作用

本研究测定了根用菊苣‘Hera’内源激素 IAA、CTK 和 GA 在不同生长阶段肉质根中的含量，进一步认识了肉质根发育生理过程。在生长前期赤霉素（GA）的含量显著高于其他时期，说明高浓度GA可能作用于种子萌发和幼苗生长；生长中期GA含量减少，说明低浓度GA可能对菊苣根中期膨大发育有促进作用；生长后期 GA 含量有升高的趋势，可能对终止肉质根营养生长起重要作用［30］。细胞分裂素（CTK）在各个发育时期含量也呈先下降再上升的趋势，说明CTK可能在生长前期（S1～S2）主要作用于芽的分化和根的形成；在生长中期CTK含量较低，此时促进细胞质分裂，促使菊苣的肉质根膨大；生长后期CTK含量又出现略微升高的趋势，可能与CTK有延缓植物衰老的作用有关［31］。生长素（IAA）在各个时期呈先下降后升高的趋势，在播种后" 25 d（对应S1）时含量最高，可能与IAA促进侧根与不定根的形成有关［32］。

3.4 转录因子对菊苣肉质根膨大发育的调控" 作用

本试验建立在之前不同发育时期肉质根样品转录组分析的基础上，并根据基因功能注释和文献报道选择多个转录因子基因，这些候选基因的同源基因参与了根发育的调控。如拟南芥侧根的形成依赖于" AtERF13［33］；而菊苣形成肉质主根的同时，也极大地抑制了侧根的生长。在杨树中，过表达" bZIP53导致不定根形成受到抑制［34］。 bHLH13在水杨酸介导的防御反应中发挥重要作用，与植物逆境适应性有关［35］。因此，本研究将" CiERF13等作为候选基因开展了表达量分析。

主根增厚伴随着果聚糖在菊苣根中的积累，迄今为止，已经确定3种TFs， CiMYB3、 CiMYB5和 CiMYB17是菊苣中果聚糖的调节因子［36-38］。 因此，在菊苣主根增厚过程中，可能存在更多有助于控制果聚糖代谢的TFs，值得探索。然而，一个关键的挑战是准确地确定从预膨胀到贮藏根的过渡过程中的临界点，并确定控制这一关键发育过渡的核心调控因素。据报道，红薯中的NAC结构域转录因子 IbNAC083是贮藏根膨胀起始的核心调节因子，其相关的DEG导致代谢过程的功能障碍，包括木质素、黄酮醇和淀粉的生物合成，为向膨胀根的过渡奠定基础［39］。因此，在未来的研究工作中应重视CiNAC-TFs；同时，菊苣主根增厚的“临界点”也值得明确考虑。

在本研究的基础上，将来有待深入开展根用菊苣和叶用菊苣肉质根发育多层面的比较，如开展不同组织结构的显微观察、果聚糖代谢谱的比较等。同时，在研究转录因子表达量的基础上，今后应结合GO富集、KEGG等注释工具，以及基因功能验证等工作，深入解析转录因子在肉质根形成中的调控机理，并利用生物信息学工具加强转录因子家族如MYB类、NAC类的研究，以便更好地开发转录因子在菊苣肉质根遗传调节、基因工程改良等方面的价值。

4 结" 论

盆栽根用菊苣与叶用菊苣形态和农艺性状差异显著，是研究菊苣肉质根发育的良好材料；将根用菊苣肉质根膨大8个发育时期划分为膨大前期（S1～S3）、膨大中期（S3～S6）和膨大后期（S6～S8）。根用菊苣肉质根中葡萄糖、果糖含量均高于叶用菊苣，根用菊苣生长素（IAA）、细胞分裂素（CTK）和赤霉素（GA）含量均呈现中期低于前期和后期，糖和激素可能协同作用于肉质根的膨大发育。多个转录因子在播种后38" d（S2时期）呈现高表达，暗示S2可能为菊苣肉质根膨大的关键时期。

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Taproot Thickening and" Its Changes in Physiology and Gene Expression of Chicory

HOU Zhiqiang1， YANG Shipeng2， ZHANG Haiwang2， WANG Lihui2 and" SUN Xuemei2

（1.State Key Laboratory of Plateau Ecology and Agriculture， Qinghai University，Xining "810016， China;

2.Academy of Agriculture and Forestry， Qinghai University， Xining 810016，China）

Abstract Toexplore the agronomic performance， physiological indicators， and gene expression changes during" taproot thickening in chicory （Cichorium intybus L.）. potted root chicory cultivar ‘Hera’ and leaf chicory cultivar ‘Commander’ were used as materials. Taproot samples from 8 developmental stages were collected to quantitatively analyze sugar and endogenous hormones levels， and qPCR expression of transcription factor genes. The results showed that root diameter， root dry mass， root/shoot ratio， and root sink activity of root chicory were higher than those of leaf chicory. The highest levels of fructose， glucose， and sucrose in ‘Hera’'s taproot occurred during the S2， S3， and S4 periods， respectively， with the glucose and fructose contents higher in taproot of ‘Hera’ compared to ‘Commander’. Indole-3-acetic acid （IAA）， cytokinin （CTK）， and gibberellic acid （GA） levels in taproot of ‘Hera' was high in the early stage， low in the middle stage and high in the late stage of taproot thickening. Transcription factors CiMYB73， CiERF13， CiNAC017， and CibZIP53 exhibited high expression at 38 days after sowing （S2 stage）. It concluded that there is a significant difference in the agronomic traits between potted root chicory and leaf chicory. Sugar and hormones may synergistically affect the taproot thickening， and 38 days after sowing may be a critical period for the development of taproot in chicory. This study provides a reference for future genetic regulation research and genetic engineering improvement of chicory taproots.

Key words Chicory （Cichorium intybus L.）; Taproot thickening; Sugar; Endogenous hormone; Transcription factor

Received "2023-06-27 """Returned 2023-10-01

Foundation item Science and Technology Plan Project" of Qinghai Province （No.2021-ZJ-953Q）.

First author HOU Zhiqiang，male， lecturer.Research area：forage cultivation and genetic breeding. E-mail：houzhiqiang@qhu.edu.cn

Corresponding"" author SUN Xuemei，female， associate research fellow.Research area：physiology and genetic breeding of composite vegetables. E-mail：sunxuemei1008@163.com

（责任编辑：潘学燕 Responsible editor：PAN Xueyan）