大花序桉径向生长相关基因表达分析

摘 要：【目的】研究不同径级的大花序桉形成层的差异表达基因和表达模式，从基因表达水平揭示大花序桉径向生长的相关机制，为林木遗传育种和培育提供有益参考。【方法】采用Illumina HiSeq 2000测序平台对5个不同径级的大花序桉形成层的转录组进行测序，使用featureCount软件计算基因表达水平FPKM，通过edgeR和TCseq进行基因差异表达分析和表达模式分析。【结果】转录组测序经质控后获高质量reads共1 364 837 824条，平均GC含量51.07%，与参考基因组的比对率平均为68.49%。对不同径级的大花序桉转录组进行差异表达基因分析，共筛选出8 794个差异表达基因，其中超高径级组Vs中径级组筛选出3 292个（上调表达1 878个，下调表达1 414个），大径级组Vs中径级组筛选出3 876个（上调表达2 314个，下调表达1 562个），小径级组Vs中径级组筛选出3 604个（上调表达1 599个，下调表达2 005个），超低径级组Vs中径级组筛选出4 565个（上调表达2 850个，下调表达1 715个）。差异表达基因的GO和KEGG分析显示，差异表达基因主要富集在糖基转移酶活性、有机环化合物结合、氧化还原酶活性等功能中，参与细胞色素P450代谢、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢、黄酮类生物合成等与次生木质部形成相关的代谢途径。基因表达模式分析将所有基因聚类为10个模式，其中模式9的基因随径级的降低表达量呈下降趋势，主要富集在Hippo信号通路、萜类骨架生物合成等代谢通路。【结论】大花序桉径向生长与多个代谢途径相关，其中与木质素合成相关的苯丙氨酸代谢途径可能是较为重要的途径，Hippo信号通路可能参与树干大小的调控。

关键词：大花序桉；转录组；径向生长；差异表达基因；基因表达趋势

中图分类号：S722.3 文献标志码：A 文章编号：1673-923X（2024）10-0149-08

基金项目：广西优良用材林资源培育重点实验室项目（2020-A-01-01）；广西林业科技项目（桂林科研[2021]5号）。

Analysis of gene expression related to radial growth of Eucalyptus cloeziana

CHEN Shengkan1， LU Youwei2， DENG Ziyu1， LI Changrong1

（1. Key Laboratory of Central South Fast-growing Timber Cultivation of National Forestry and Grassland Administration， Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation， Guangxi Forestry Research Institute， Nanning 530002， Guangxi， China； 2. Guangxi Gaofeng State-owned Forestry Farm， Nanning 530025， Guangxi， China）

Abstract：【Objective】The study was intended to study the gene expression profile of different diameter grade of Eucalyptus cloeziana to reveal the mechanism of radial growth at the gene expression level.【Method】We sequenced the cambium transcriptomes of five different diameter grades E. cloeziana using the Illumina HiSeq 2000 sequencing platform. Gene expression level was calculated using featureCount software. Difference expression and expression pattern analysis were performed by edgeR and TCseq.【Result】A total of 1 364 837 824 high-quality reads were obtained after quality control， with an average GC content of 51.07% and an average alignment rate of 68.49% to the reference genome. Difference expression analysis of all comparison groups screened 8 794 different expressed genes （DEGs）. 3 292， 3 876， 3 604 and 4 565 DEGs were screened in the comparison ultra-high diameter group， large diameter group， small diameter group， ultra-low diameter group Vs medium diameter group， respectively， and with 1 878 up-regulated and 1 414 down-regulated， 2 314 up-regulated and 1 562 down-regulated， 1 599 up-regulated and 2 005 down-regulated， 2 850 up-regulated and 1 715 down-regulated in these comparison， respectively. GO and KEGG analysis showed that DEGs were mainly enriched in glycosyltransferase activity， organocyclic compound binding， oxidorereductase activity， and were reported to be involved in cytochrome P450 metabolism， phenylpropane biosynthesis， phenylalanine metabolism， flavonoid biosynthesis and other metabolic pathways related to secondary xylem formation. Gene expression pattern analysis clustered all genes into 10 patterns， among which the genes in pattern 9 showed a downward trend with the decrease of diameter and were mainly enriched in Hippo signaling pathway and terpenoid backbone biosynthesis.【Conclusion】The radial growth of E. cloeziana is related to multiple metabolic pathways， among which the phenylalanine metabolic pathway related to lignin synthesis may be an important one， and the Hippo signaling pathway may be involved in the regulation of diameter size.

Keywords： Eucalyptus cloeziana； transcriptome； radial growth； different expression gene； gene expression trend

大花序桉Eucalyptus cloeziana是桃金娘科Myrtaceae桉属Eucalyptus昆士兰桉亚属Idiogenes树种，天然分布于澳大利亚昆士兰州，具有4个不连续的地理分布区，其木材坚硬耐久、纹理通直、结构均匀，材色呈黄褐色，具有黑金条纹，广泛用于家具、建筑、矿柱和坑木等，是较好的锯材树种，在我国已作为大径材进行培育[1-4]。大花序桉作为大经级锯材培育的周期在15～20 a，与尾叶桉E. urophylla、巨桉E. grandis及其杂种无性系等纤维材相比，其生长速度较慢，而生长量一直以来都是林木育种和培育的重要指标，包括高生长和径向生长，林木径向生长速度的提高能够极大地促进林木蓄积量的增长，因此，解析林木径向生长机制对林木育种和培育均具有重要意义。

对林木径向生长的研究大多数集中在对气候等环境因子的响应，如贾存等[5]研究了华北落叶松Larix principis-rupprechtii人工林和天然林径向生长对气温变化的响应；杨保国等[6]研究了米老排Mytilaria laosensis径向生长的变化规律及其对辐射总量、土壤含水量、相对空气湿度、空气温度等环境因子的响应；曹受金等[7]研究了气候变化对不同纬度马尾松Pinus massoniana径向生长的影响。对林木径向生长差异的分子调控机制的研究较少，主要在杨树Populus[8]、巨桉[9]等用材树种中开展，林木径向生长的遗传调控机制尚未清晰，仍需进一步研究。

林木的径向生长（即次生木质部生成）主要依赖于树干侧面分生组织维管束形成层细胞的分裂和分化。维管束形成层细胞向外分化形成次生韧皮部，向内分化形成次生木质部，形成层通过不断分裂和分化增加木质部的细胞数量，使林木径向增粗[10-11]。次生木质部的形成过程中，形成层向内分裂形成的木质部母细胞经过初生细胞壁扩张而使细胞增大，随后一系列纤维素和半纤维素等多糖沉积，次生细胞壁开始形成并增厚，同时开始木质化。随着木质化次生细胞壁的成熟，细胞进入程序化死亡阶段，最终完成木质部细胞的分化，这一过程的各个阶段均受到内部遗传信息的严格调控[12-13]。

以往对植物径向生长发育及调控过程的研究发现，许多转录因子和植物激素在木质部生成的各个阶段均具有重要的调控作用。如形成层分裂及分化为木质部母细胞的过程，受HD-ZIP III和WOX4等转录因子的调控[14-15]，杨树中IAA3基因过表达会影响生长素信号，降低形成层细胞的分裂活动，抑制木材形成[16]；在木质部细胞扩增和伸长过程中，两种具有生物活性的赤霉素GA1和GA4主要聚集在扩增木质部细胞区域参与扩增过程[17]；次生细胞壁的合成过程主要受纤维素合酶的影响，杨树基因组中发现18个纤维素合酶基因[18]，其他一些蛋白如蔗糖酶也与纤维素合成有关[19]，此外，次生细胞壁的合成还受许多含NAC结构域的转录因子、MYB转录因子以及赤霉素、水杨酸和油菜素内酯的调控[20-22]。大量的研究表明，木本植物径向生长的分子调控十分复杂，虽取得了较大的进展，但仍有许多未知亟待解析。

本研究对相同生长环境和林龄的大花序桉形成层进行转录组测序，开展不同径级大花序桉形成层的差异表达基因和表达模式分析，挖掘大花序桉径向生长相关的基因和代谢通路，为桉树锯材树种的木材产量提高和新型优良品种的培育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验点位于广西壮族自治区玉林市容县容西镇（110°09′E，22°39′N），试验材料为2004年5月份种植的大花序桉种源试验林，试验林采取统一的抚育措施。根据胸径测定数据，设置5个不同的径级，以总体均值μ为基础径级，大于和小于总体均值1倍和2倍标准差σ各设置1个径级，每个径级选择6个单株取其形成层样品，共30个样品。取样时间为2019年7月（大花序桉生长旺季）上午9：00—11：00，在胸径处向南一侧用小刀将5 cm×5 cm的树皮割除，用解剖刀轻轻向内刮取木质部外的几层水状细胞，迅速将其用锡箔纸包好置于干冰中带回实验室提取RNA。

1.2 转录组测序及数据处理

RNA的提取利用EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒（Aidlab）进行，浓度和纯度采用NanoDrop2000（Thermo Scientific）和Qubit 3.0（Thermo Scientific）进行测定。采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit（Illumina）试剂盒构建文库，在HiSeq 2000（Illumina）测序平台上进行测序。使用Trimmomatic软件对原始测序数据过滤，去除reads中的接头序列，修剪掉3′端质量值小于20的碱基，若剩余序列中仍含有质量值小于10的碱基，则剔除整条序列，去除含N比率超过10%的reads，舍弃接头及质量修剪后长度小于75 bp的reads。使用Hisat2软件将质控后得到的高质量reads与巨桉参考基因组（Eucalyptus grandis v2.0）比对，采用QualiMap软件进行基因覆盖度分析。

1.3 基因表达水平和表达模式分析

利用R程序包edgeR对不同径级的样本进行基因表达差异分析，差异基因的筛选标准为样本组间差异倍数（Fold Change）≥2且错误发现率（FDR）<0.05，将得到的差异基因进行GO和 KEGG富集分析。通过TCseq程序包进行基因表达趋势分析。

2 结果与分析

2.1 样品胸径显著性检验

从5个不同的径级中各选取6个单株，各组的胸径平均值如表1所示，各组胸径均值分别为36.0、31.0、27.2、23.3和18.4 cm，最大组和最小组之间胸径差异较大。对各组胸径进行方差分析，结果显示不同经级样本的胸径在0.001水平上差异显著，多重比较显示5个不同组别之间均存在显著差异。大花序桉样本径向生长上的显著差异表明对其进行形成层转录组测序分析可能获得与径向生长相关的差异表达基因。

2.2 转录组测序数据统计

对大花序桉群体各个径级样本形成层进行转录组测序，共获得204 GB原始测序数据。经质控后，获得高质量reads共1 364 837 824条，平均每个样品45 494 594条；获得高质量碱基数202 857 185 891 bp，GC含量为48.53%～53.03%，平均GC含量为51.07%，Q30%（质量值≥30的碱基所占比例）为93.42%～95.44%，均值为94.48%。以巨桉基因组为参考基因组进行比对，比对率为59.05%～72.18%，平均比对率为68.49%，比对上的序列中86.42%～93.25%比对到基因组的外显子区域。测序统计结果表明，转录组测序数据质量良好，可用于下游分析。

2.3 不同径级大花序桉差异基因分析

对所有样品表达基因数量进行统计，可检测到的表达基因数量平均为20 656个，FPKM大于10的基因数量平均为7 858个。以FC≥2且FDR<0.05为显著性标准阈值，以中径级组（μ组）为对照，对不同径级的大花序桉样品进行差异表达基因分析（图1）。超高径级组（μ+2σ）样品相对中径级组筛选出3 292个显著差异表达基因，其中上调表达基因1 878个，下调表达基因1 414个；大径级组（μ+σ）样品相对中径级组筛选出3 876个显著差异表达基因，其中上调表达基因2 314个，下调表达基因1 562个；小径级组（μ-σ）样品相对中径级组筛选出3 604个显著差异表达基因，其中上调表达基因1 599个，下调表达基因2 005个；超低径级组（μ-2σ）样品相对中径级组筛选出4 565个显著差异表达基因，其中上调表达基因2 850个，下调表达基因1 715个。所有差异表达基因中，4组比较共有的差异表达基因共456个，超高径级组和大径级组上调表达基因与小径级组和超低径级组下调表达基因的共有基因共166个，超高径级组和大径级组下调表达基因与小径级组和超低径级组上调表达基因的共有基因共174个。

4个比较组共获得8 794个差异表达基因，对差异表达基因进行GO功能注释，主要集中在分子功能和生物过程两大类，较少差异基因富集在细胞成分。GO富集分析显示（图2a），差异基因的主要功能富集于ADP结合、腺苷酸结合、核苷酸结合、碳水化合物衍生物结合、糖基转移酶活性、有机环化合物结合、氧化还原酶活性等，与次生木质部的形成密切相关，包括细胞的分裂分化以及纤维素和半纤维素等多糖沉积、木质素单体合成和聚合等次生细胞壁生物合成的重要过程。差异基因的KEGG富集分析显示（图2b），差异基因显著富集于细胞色素P450代谢、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢、黄酮类生物合成、半乳糖代谢等通路，其中苯丙氨酸代谢途径在植物生长发育中具有重要作用，其下游主要有黄酮类化合物的合成分支途径和木质素的合成分支途径。

2.4 不同径级大花序桉形成层基因表达模式分析

对大花序桉形成层的表达基因进行表达模式分析，将相似表达模式的基因划分聚类，结果显示（图3），所有表达的基因共被聚类为10种表达模式，其中模式1和模式10随大花序桉径级的降低基因的表达量呈上升趋势，模式6和模式9随径级的降低基因的表达量呈下降趋势，其余模式随径级的降低基因的表达量呈不规则趋势。模式1和模式9随径级降低呈上升或者下降的趋势较为明显，所有表达基因中共2 417个基因被聚类到模式1，其中780个基因为差异表达基因，被聚类到模式9的基因共有3 060个，其中711个基因为差异表达基因。

分别对模式1和模式9的基因进行GO和KEGG富集分析，GO结果显示，模式1中基因的主要功能富集在UDP-糖基转移酶活性、有机物运输和基于微管过程等，模式9中基因的主要功能富集在大分子生物合成过程、细胞酰胺代谢过程和非膜结构细胞器等。KEGG富集分析结果显示，模式1基因主要富集在缝隙链接、磷酸肌醇代谢、内质网蛋白质加工等通路，模式9基因主要富集在Hippo信号通路和萜类骨架生物合成等代谢通路。

3 讨 论

本研究比较分析了超高径级、大径级、中径级、小径级和超小径级5个不同径级大花序桉形成层的转录组，通过与中径级转录组进行比较，共筛选出8 794个差异表达基因。进一步分析发现，差异基因主要功能富集在碳水化合物衍生物结合、糖基转移酶活性、有机环化合物结合、氧化还原酶活性等，这些功能均与次生木质部的形成密切相关。其中，糖基转移酶在次生细胞壁的生物合成中较为重要，GO分析显示基因表达模式分析中模式1基因的主要功能同样富集在UDP-糖基转移酶活性，糖基转移酶的活性在大花序桉径向生长中具有重要作用。糖基转移酶广泛存在于植物中，是专门催化糖基从活化的供体分子转移到糖类或非糖类受体分子上形成糖苷的酶，其供体分子通常为尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-glucose）[23-24]。较多研究表明糖基转移酶参与木本植物次生细胞壁中碳水化合物的合成和架构，直接影响木质部的发育过程，如杨树中已鉴定出25个与木材相关的糖基转移酶[25]；若干糖基转移酶家族成员参与葡糖木聚糖的生物合成[26]；通过对特定组织进行基因表达转录组学和生物信息学等分析，发现杨树的纤维素合酶基因属于糖基转移酶家族[27]。

木本植物的径向生长与木质素的生物合成密切相关，木质素的合成和积累速度越快，径向生长速度越快。木质素是植物次生细胞壁所特有的一种苯丙烷类次生代谢物，主要由3种单体ρ-香豆醇（ρ-coumaryl alcohol）、松柏醇（coniferyl alcohol）和芥子醇（sinapyl alcohol）通过自由基偶联聚合而成[28]。3种木质素单体是苯丙氨酸代谢途径的终产物，苯丙氨酸经过脱氨反应后，在芳香环上发生一系列的羟基化和甲基化修饰，侧链发生氧化还原反应，最终形成3种单体[29]。木质素单体合成的一系列反应由多个酶介导，包括一个解氨酶（PAL）、3个不同的细胞色素P450酶（C4H、C3′H和F5H）、2个甲基转移酶（CCoAOMT和COMT）和2个氧化还原酶（CCR和CAD）等。陈沫等[30]挖掘和鉴定了不同种植密度下尾巨桉木质部生成的关键基因，获得了一批响应种植密度的木质部生成重要转录因子。本研究在对不同径级差异基因的KEGG富集分析中发现，差异基因显著富集于细胞色素P450代谢、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢、黄酮类生物合成等代谢途径，与木质素的生物合成密切相关，表明这些差异基因对大花序桉的径向生长有重要作用。

对林木径向生长分子调控机制的研究多采用幼苗作为研究材料，如Du等[31]对银腺杨“84K”P. alba×P. glandulosa幼苗6个不同发育阶段的茎段，通过单细胞空间转录组研究其从初生生长到次生径向生长的连续发育过程；Zhou等[9]对巨桉幼苗第3节间到第11节间茎段的发育梯度进行了转录组分析，解析了巨桉茎段从初生生长向次生生长转变的差异表达基因，得到了可能对次生生长重要的基因和转录因子。然而，林木在主茎干上的径向生长是林木蓄积增长的重要来源，主茎干上形成层的分裂分化活动可能与幼苗顶芽茎段存在差异。本研究以15年生的大花序桉为材料，对其胸径处的形成层进行转录组分析，解析径向生长相关的基因表达，对林业生产更具意义。

基因表达模式分析中，模式9随径级的降低基因的表达量呈下降趋势，对模式9基因的KEGG富集分析显示，模式9基因主要富集在Hippo信号通路、萜类骨架生物合成等代谢通路。其中Hippo信号通路是调控动物细胞分裂、器官大小的信号通路，植物中同样存在与Hippo信号通路核心元件Hippo/MST1/2和MOB1/Mats同源的SIK1和MOB1蛋白[32]。植物Hippo信号通路的首要功能可能是促进细胞分裂退出与启动核内复制周期，从而调控植物器官大小。对拟南芥sik1突变体的研究发现，突变体各器官大小、成熟器官细胞数量、细胞大小、核内复制水平均显著小于野生型，叶肉细胞退出有丝分裂、启动核内复制的时机晚于野生型[33]。模式9中富集在Hippo信号通路的基因，其表达趋势与拟南芥sik1突变体的研究结果相符，径级即为器官大小，随径级的降低基因的表达量呈下降趋势，模式9的基因与大花序桉径向生长相关。

本研究以大花序桉为材料开展径向生长相关的转录组研究，分析不同径级形成层的差异表达基因和表达趋势，挖掘径向生长相关的基因和代谢通路，有助于理解桉树径向生长的遗传调控机制，促进桉树分子育种，提高桉树锯材树种的木材产量和质量，为新型优良品种的培育提供理论基础。然而，本研究只初步解析了径向生长相关的差异表达基因及相关代谢通路，后续仍需对径向生长起关键作用的基因或转录因子进一步挖掘、解析和验证。

4 结 论

为了解大花序桉径向生长的机制，本研究对不同径级的大花序桉形成层转录组进行了测序，并开展了基因差异表达分析和表达模式分析。基因差异表达分析结果显示，不同径级的大花序桉存在大量的差异表达基因，主要富集于细胞色素P450代谢、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代谢和黄酮类生物合成等与次生木质部密切相关的重要代谢途径。基因表达模式分析结果显示，所有表达基因聚类为10个不同的表达模式，其中模式1和模式9分别随着径级的降低表达量呈现上升和下降趋势，模式1基因的主要功能富集在UDP-糖基转移酶活性，模式9基因主要富集在Hippo信号通路、萜类骨架生物合成等代谢通路。本研究从转录组水平初步揭示了大花序桉径向生长相关的差异表达基因及相关的代谢通路，有关结果对深入研究林木径向生长机制，创制桉树优良新品种具有一定的参考价值。

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[本文编校：吴 彬]