山羊分子生物学研究进展骆美蓉

江明锋　张鹏　王永

摘要：综述了近年来国内外关于山羊分子生物学方面的研究进展，介绍了山羊起源分化和遗传多样性的分子标记研究、山羊相关经济性状的主要功能基因以及山羊在基因组、转录组和蛋白质组方面的研究进展，讨论了山羊研究存在的问题和发展趋势。

关键词：山羊；分子标记；功能基因；基因组；转录组；蛋白质组

中图分类号： S827.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0046-04

收稿日期：2013-04-22

资助项目：国家科技支撑计划（编号：2012BAD13B06）；教育部科学技术研究重点项目（编号：210265）；四川省科技创新产业链示范工程重大项目（编号：2011NZ0003）；西南民族大学研究生创新型科研项目（编号：CX2011SP44）。

作者简介：骆美蓉（1987—），女，河南信阳人，硕士研究生，主要从事羊遗传育种方面的研究。E-mail：xygzlmr@126.com。

通信作者：王永，博士，教授，博士生导师，研究方向为动物遗传育种。E-mail：wangyong010101@swun.cn。山羊是世界上最早驯养的家畜之一，其品种多样，适应性强，分布广泛，经济效益大。据联合国粮食和农业组织统计，目前世界上共有1 000多个山羊品种，近8.3亿只山羊。近年来，发展中国家养羊业发展迅速。我国已成为世界上山羊饲养量、出栏量、羊肉产量最多的国家。同时山羊产业成为我国大部分地区畜牧业的重要支柱。但是国内外关于山羊的研究尤其是功能基因的研究大多是通过牛和绵羊相关研究成果来进行的。山羊在分子生物学上的研究远落后于猪、牛、绵羊等家畜。随着山羊全基因组测序的完成和全基因组图谱的公布，山羊的科学研究随之进入到一个全新时代。

1山羊分子标记及遗传多样性分析

分子标记是以DNA多态性为基础的遗传标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映，目前已发展到第3代分子标记。在山羊产业中应用广泛的分子标记技术包括限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）标记、简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）等。

山羊分子标记研究主要应用于山羊的起源分化和遗传多样性分析。虽然科研人员早在1962年就开始研究家山羊的起源和遗传多样性，但至今家山羊的起源和遗传多样性仍具有不确定性[1]。近10年来，家山羊起源分化和遗传多样性的研究主要是通过线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）进行的。mtDNA基因组序列一般无间隔、结构简单、突变率高、严格的母系遗传，而这是其成为首要研究对象的主要原因。科研人员通过对mtDNA的研究发现山羊有7个支系起源（A至G），其中B支系只存在于亚洲东南部。因此Lin等对东南亚12个国家共计1 661只山羊mtDNA进行RFLP分析，以期进一步探究亚洲山羊的起源[1]。结果表明，亚洲家山羊可分为4个支系：A和B支系山羊占主导地位，C和D支系山羊频率低且只存在于中国、巴基斯坦和印度。近期，A支系山羊向东南亚地区渗透，但B支系山羊在东南亚仍具有优势，且有向东南方向增加的趋势。王杰等也根据前人的研究对我国7个山羊品种的mtDNA D-loop区进行了RFLP标记，发现我国山羊有4个支系起源（A至D）且具有很高的遗传多样性[2]。王志刚等对我国39个地方山羊品种进行SSR标记，其关于我国山羊遗传多样性的分析与王杰一致[3]。总的来说，我国山羊具有较高水平的遗传多样性，其中北方地区山羊遗传多样性最为丰富。遗传变异主要存在于品种内，品种间遗传分化处于中等水平，选育潜力大。在遗传资源保护方面，应防止盲目杂交并选取具有代表性的山羊品种进行保护。

2山羊主要功能基因研究

山羊在分子生物学方面研究最多的是山羊疾病及其抗病基因，其次是山羊经济性状相关基因的研究。据此，将山羊功能基因划分为毛、肉、乳、繁殖、免疫5个性状进行阐述。表1列举了山羊这5个性状的主要相关基因。表1山羊候选基因及其与性状间的关系

候选基因1性状1候选基因与性状的相关性1 文献生长激素基因1体重1AACD基因型抑制体重增加1[4]肌肉生长抑制素1肉产量1AB基因型和ABCD基因型促进体重增加1[5]促性腺激素释放激素1繁殖性状1CC和CT基因型能增加产羔数1[7]酪蛋白相关基因1产乳量及风味1丰富的SNP可增加产乳量，乳糖、脂肪、蛋白的含量1[8]POU1F11产乳量、质量及绒产量1丰富的SNP可提高产乳量，提高乳质量；其TT基因型增加绒产量1[9，11]泌乳素基因1绒长度1其X76049：g.576位点为C时增加绒长1[10]褪黑激素受体基因1绒产量1其基因型为AA时增加绒产量1[12]主要组织相容性复合体1免疫性状1对动物抗病、抗逆性和免疫调节有重要作用1[13]

2.1影响山羊产肉性状的功能基因

波尔山羊作为优秀的肉用山羊品种被引进我国，以期提高我国本地山羊的产肉性能。为找到增加山羊产肉量的主效基因以更好地进行山羊繁殖育种工作，Hua等对波尔山羊的生长激素基因进行了研究[4]，Zhang等对其肌肉生长抑制素基因进行了变异分析[5]，结果发现，生长激素基因的AACD基因型对体重的增加有抑制作用而其他基因型对体重、体长的影响不明显；肌肉生长抑制素基因的AB基因型和合并基因型ABCD能够显著促进山羊体重的增加。

2.2影响山羊繁殖性状的功能基因

对山羊繁殖性状功能基因的研究主要集中在绵羊多胎的分子标记基因上，如骨形态发生蛋白及其受体基因和生长分化因子9等。而Ahlawat等研究发现印度本地山羊中并未发现这些基因存在与多胎性状相关的突变，这与我国科研人员在研究本地山羊多胎相关基因时情况相似[6]。据此可看出依靠绵羊繁殖性状的基因对山羊繁殖相关功能基因的研究具有一定的局限性。严泉梅等对促性腺激素释放激素（GnRH）基因遗传变异的研究突破这一局限，发现在人类中与性早熟相关的GnRH的CC基因型和CT基因型能使西农萨能奶山羊和布尔山羊的产羔数显著增加[7]。

2.3影响泌乳性状的功能基因

近期科研人员在寻找人类代乳品时发现山羊奶最为适合。这一结论促使羊奶相关特性和功能基因得到进一步的研究。Dagnachew等进行了酪蛋白相关基因单核苷酸多态性与山羊泌乳量相关性的研究，结果显示CSN1S1和CSN3的单核苷酸多态性对山羊乳产量、风味及质量有显著的加性效益且起主导作用[8]。Daga等通过POU1F1基因多态性研究发现，其第2外显子17位点的变异可使乳产量增加；58位点的变异通过增加乳中蛋白质和脂肪的含量来提高羊奶质量[9]。总的来说，改善山羊奶风味是目前奶山羊育种面临的最迫切也是最重要的问题，而这也是将来开展相关研究的方向。

2.4影响产绒或产毛性状的功能基因

除去研究人员普遍认同的角蛋白基因和角蛋白辅助蛋白基因外，Lan等将对乳产量有显著影响的泌乳素（PRL）基因和对PRL有正调节作用的POU1F1基因多态性与山羊绒性状进行相关性分析[10-11]，结果发现PRL基因有一特殊变异与绒长度相关，且其等位基因为C时山羊绒更长；POU1F1的TT基因型与山羊绒产量正相关。Lan等发现能提高乳产量的功能基因也与绒产量相关，从而为白绒山羊产绒量的提高提供了辅助选择的分子标记。繁殖性状相关功能基因与绒产量关系的探讨也是十分重要的。刘斌等选择褪黑激素受体（melatonin receptor，MTNR）基因来进行研究，结果在MTR1b基因外显子2中检测到AA、AB、BB 3种基因型[12]。通过与山羊绒相关性分析发现：AA基因型对绒产量有显著影响；与年龄的互作效应对山羊绒厚度有显著影响，对绒细度存在边际显著影响。

2.5山羊免疫相关功能基因

主要组织相容性复合体（MHC）在动物免疫应答反应中起着重要作用。更为重要的是MHC可识别并清除外在抗原且有多个高度多态的基因位点都与免疫相关。以前关于山羊MHC的研究多集中在Class II区DR和DQ亚区基因的多态性上，而最近公布的山羊全基因组图谱对山羊MHC进行了整体研究。研究发现，山羊MHC位于23号染色体，由2个大小分别为2.25 Mb和360 kb的区域组成。与绵羊MHC相比，山羊MHC含有160个基因，比绵羊MHC少了16个。Dong等通过基因注释对绵羊、山羊和人MHC上的保守基因进行分析，发现有些保守基因有倒置情况，但总体来说它们的保守基因表现出高度共线性[13]。它们比较分析的具体情况见图1。

3山羊基因组学研究进展

3.1山羊遗传连锁图谱构建

遗传图谱能够显示遗传标记在连锁群上的相对位置，也能帮助非模式生物运用比较基因组学进行相关研究。遗传图谱的构建是发现近缘物种间适应表型差异遗传机制的第一步。因此，Vaiman等早在1996年时就用12个半同胞家系山羊（萨能奶山羊和阿尔卑斯山羊参与杂交）构建得到山羊低分辨率连锁图谱[14]。该连锁图谱全长为2 300 cM，由219个微卫星标记组成，标记物种来源于牛（占总标记数的74.9%）、绵羊（占总标记数的20.5%）和山羊（占总标记数的 4.6%）。其中204个微卫星标记整合进了连锁群，其余的用荧光原位杂交（FISH）法得以物理定位。该山羊连锁图谱虽然分辨率低，却是目前构建最完整的山羊遗传连锁图谱，占山羊基因组的80%。此外，徐磊等、王敏等对绒山羊的11号

染色体和X染色体用SSR技术构建了连锁图谱，其中徐磊等构建的X染色体遗传连锁图谱与英国罗斯林研究所公布的SM 47绵羊连锁图标记顺序一致[15-16]。他们与Vaiman等所构建的遗传图谱的比较见图2。

3.2山羊基因组测序

3.2.1山羊线粒体基因组Parma等在2003年首次完成了长度为16 640 bp的山羊线粒体基因组的全部测序工作[17]。其中包括了rRNA（12S和16S）、22个tRNA和13个蛋白编码区的基因序列。通过比较山羊、牛和绵羊的蛋白编码区基因，发现山羊与牛之间的差异为1.2%～12.2%（均值为73%）；山羊与绵羊之间的差异范围是0～15.6%（均值为47%）。只从差异均值来看，山羊与绵羊的亲缘关系更近。Hassanin等[18]对山羊线粒体基因组进行了重测序，通过与Parma等公布的序列比较发现其测序结果存在很多错误：Parma等所测基因组序列仅占总长度的44.5%；1 201 nt 和 2 384 nt 片段测序错误率极高。此外，Hassanin还发现了核线粒体假基因（Numt）的存在，并通过克隆最终得到2个Numt序列。通过对髯羊（Ammotragus）、山羊（Capra）、塔尔羊（Hemitragus）和岩羊（Pseudois）假基因系统发育学方面的分析，推测出它们拥有共同的祖先。

3.2.2山羊全基因组虽然我国山羊分布范围及经济效益明显大于绵羊，但与绵羊相比山羊基因组的研究严重滞后。近期中国科学院昆明动物研究所联合国内外大学展开了山羊基因组的研究，并于2012年12月公布了全球首个山羊全基因组图谱，同时建立了山羊基因组和转录组数据库。研究中，Dong等采用第2代测序技术（NGS）对1只雌性云南黑山羊2.66 Gb的基因组进行了测序[13]。测序所得短序列通过基因组酶切图谱（whole-genome mapping）技术和传统的组装方法进行拼接得到超长scaffold，然后利用与牛的保守共线性（conserved synteny）将scaffold定位到染色体上。将所测基因组从蛋白编码基因、非蛋白编码基因、转座子和基因家族4个方面进行基因注释，共得到22 175个蛋白编码基因，其中 17 927 个基因也在转录组测序中检测到。对注释基因的分析主要从基因家族进化和正选择基因2个方面进行。

从基因家族进化方面分析注释基因发现山羊与牛有 17 129 对直系同源基因，与人类有16 771对直系同源基因。在所构建的系统树图中可以看出山羊和牛在2 300万年前有共同祖先。但在将与基因组和基因进化相关的转座子进行比较时发现，牛基因组中SINE-BovA型的转座子多，而山羊基因组中则是SINE-tRNA转座子数量大。在将山羊基因组中各种类型的转座子分化程度进行分析时发现较近时期分化的转座子很少。在正选择基因方面主要研究了和免疫相关的主要组织相容性复合体（MHC）。MHC的详细信息对山羊的免疫和接种具有重要价值。

4山羊转录组学和蛋白质组学研究进展

基于山羊的重要经济价值，山羊转录组学和蛋白质组学研究集中在山羊绒。Dong等通过对绒山羊初级毛囊和次级毛囊转录组的比较分析得到山羊绒的功能基因[13]。研究表明，2个角蛋白基因和10个角蛋白辅助蛋白基因在羊绒纤维结构中起着重要作用；纤维母细胞生长因子21基因、酪蛋白激酶Iε基因与山羊绒性状相关；天冬氨酰合成酶、磷酸丝氨酸转氨酶、α-1蛋白、桥粒芯蛋白等与毛囊发育和毛囊形态发生有关。其中角蛋白辅助蛋白可分为高硫角蛋白辅助蛋白、超高硫角蛋白辅助蛋白和高甘氨酸酪氨酸蛋白三大类[13]。他们在3类角蛋白辅助蛋白的进一步研究中发现超高硫角蛋白辅助蛋白对羊绒的形成起着十分重要的作用。松杰等通过构建绒山羊皮肤蛋白质双向电泳图谱，对绒山羊皮肤的蛋白质分布和表达情况有了全面了解，为绒山羊皮肤蛋白质组成和差异蛋白质的研究奠定了基础[19]。

5小结与展望

虽然山羊分子生物学方面的研究在逐年增加并取得了不少的成绩，但仍不能满足山羊市场快速增加所产生的需求。最近山羊全基因组序列的公布和转录组方面的研究拓展了山羊功能基因的研究方法，为山羊生长发育、生理机理、抗病机理分子机制的研究奠定了基础，为构建山羊基因芯片、分析预测基因功能拓展了研究空间。但不可否认的是山羊基因组、转录组和蛋白质组的研究起步较晚，还有很多相关信息需要进一步地分析鉴定。现如今山羊功能基因的研究被局限在了功能基因单核苷酸多态性与生产性能相关性的研究上，而其研究方法多是根据牛和绵羊的相关研究成果进行的。更不利的是，功能基因多态性的研究因山羊品种、所处环境等存在差异。就目前的研究而言，山羊主效功能基因仍未被发现。因此，还必须对大量未知的和已知的基因和蛋白进行更为详尽的分析和鉴定，从而为山羊主要经济性状的遗传改良提供理论依据和技术支撑，为山羊的良种繁育、遗传多样性的保护奠定基础。

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