壳聚糖酶产生菌的选育及产酶能力研究

温钢　刘海燕　杨梅

摘要：从某水产市场附近土壤中分离筛选出4株具壳聚糖酶能力的微生物菌株，其中菌株S03具有较高的产酶能力，经鉴定属于毛霉属（Mmucor sp.）。试验条件下该菌株培养3 d时，发酵液中壳聚糖酶活性最高。并进一步证明该菌株所产壳聚糖酶属于诱导型壳聚糖酶，适量添加葡萄糖有助于壳聚糖酶的产生。

关键词：壳聚糖酶；酶活力；鉴定

中图分类号： Q939.9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0347-02

收稿日期：2013-05-07

作者简介：温钢（1976—），男，吉林四平人，硕士，讲师，研究方向为应用微生物。E-mail：315554062@qq.com。壳聚糖（chitosan）别称甲壳胺，是甲壳质脱去部分乙酰基的产物，是一类由2-氨基-2-脱氧-葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-葡萄糖（<40%）单体通过β-1，4糖苷键连接而成的直链多糖[1]。壳聚糖是自然界中唯一的天然阳离子高聚物，其特殊的化学结构决定了这种高聚物有着独特的生物活性。壳聚糖具有提高人体免疫力、促进伤口愈合、降血脂、降血压等保健作用，是一种有广泛应用前景的医疗保健材料[2]。另外，壳聚糖还有很好的杀菌、抑菌作用。但是由于壳聚糖分子量大，不溶于水，不易被人体吸收，从而限制了这种物质作为医疗保健品的应用。利用壳聚糖降解得到壳低聚糖，不但容易被人体吸收，而且某些壳寡聚糖还有许多新颖的生物活性，在治疗癌症和提高人体免疫力方面有很好的试验效果[3]。目前降解壳聚糖的方法主要有化学降解法和酶降解法，其中酶降解法以降解过程容易控制、反应条件温和以及对环境没有污染等优点成为壳聚糖降解的首选途径[4]，因此进一步选育壳聚糖酶产生菌株就显得尤为重要。本研究选育出具有一定产壳聚糖酶能力的菌株，并初步考察了其产酶能力，以期为后续壳聚糖酶发酵生产及应用研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

壳聚糖和氨基葡萄糖购于国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

胶体壳聚糖：取5 g壳聚糖加入100 mL 0.4 mol/L HCl溶液中，50 ℃搅拌至壳聚糖完全溶解，加入1 mol/L NaOH溶液调节pH值至5.0，得5%胶体壳聚糖。

1.2培养基

胶体壳聚糖液体培养基：A液：1%胶体壳聚糖；B液：04% K2HPO4·3H2O，0.2% KH2PO4，0.14% MgSO4·7H2O，0.1% NaCl，0.1% KCl，0.02% CaCl2，0.1%酵母粉，3%琼脂，pH值7.2；将A液、B液分别灭菌后等体积混合。

壳聚糖粉末培养基：1%壳聚糖粉末，0.07% K2HPO4·3H2O，0.03% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，0.03%蛋白胨，0.03%酵母粉，pH值7.2。

1.3方法

1.3.1菌株初筛将采集土样加入适量蒸馏水摇匀，梯度稀释后，涂布于胶体壳聚糖固体培养基平板上，30 ℃培养3～5 d，逐一挑取平板上生长状况良好且能够形成水解圈的菌株，再次接种于胶体壳聚糖固体培养基平板，测定菌落直径和透明圈直径，进一步比较菌株利用壳聚糖的能力。将分离所得菌株分别编号，进一步参考相关文献[5]进行菌种鉴定。

1.3.2菌株降解能力考察将菌株接种于壳聚糖液体培养基中，接种后于150 r/min、30 ℃振荡培养，定时取样，12 000 r/min 离心10 min后得粗酶液，采用DNS法测定壳聚糖酶活性[6]。具体方法为：在0.5 mL粗酶液中加入磷酸缓冲液（pH值7.2）1.0 mL和1%胶体壳聚糖0.5 mL，混匀后于46 ℃保温30 min，沸水浴10 min。4 000 r/min离心5 min后，取2 mL上清液与1 mL DNS试剂混合，沸水浴中反应5 min后冷却至室温，加入4 mL去离子水，混匀后于540 nm处测定吸光度，并根据氨基葡萄糖标准曲线计算壳聚糖酶活性。

酶活性单位的定义：pH值 7.2、温度46 ℃时，1 mL样品1 min催化生成1 μmol氨基葡萄糖的还原糖量所需的酶量为1个酶活单位（U/mL）。

1.3.3菌株生长曲线的测定将菌株接入液体培养基中培养，定时取样，测定菌体干重和发酵液酶活性，考察菌株生长曲线和酶活性随时间变化的规律。

1.3.4其他影响菌株产酶能力因素的考察

1.3.4.1不同碳源对产酶诱导的影响在液体培养基中，分别以1%壳聚糖粉末、1%胶体壳聚糖、1%甲壳质、1%可溶性淀粉、1%葡萄糖、1%蔗糖、1%壳聚糖粉末+0.1%葡萄糖、2%壳聚糖粉末+0.1%葡萄糖、5%壳聚糖粉末+0.1%葡萄糖、1%壳聚糖粉末+1%葡萄糖作为碳源，接入菌种后150 r/min、30 ℃振荡培养72 h，测定壳聚糖酶活性，考察碳源对菌株产酶能力的影响。

1.3.4.2培养温度对产酶的影响将菌株接入装有100 mL壳聚糖粉末液体培养基的250 mL三角瓶中，分别在25、28、30、35、37 ℃下150 r/min振荡培养3 d后，测定发酵液酶活性，考察培养温度对菌株产酶的影响。

1.3.4.3培养基起始pH值对产酶的影响将菌株接入装有100 mL壳聚糖粉末液体培养基的250 mL三角瓶中，将培养基起始pH值分别调至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，150 r/min振荡培养72 h后，测定发酵液酶活性，考察培养基起始pH值对菌株产酶的影响。

2结果与分析

2.1菌株初筛

经富集培养、反复划线分离与纯化，得到4株能在胶体壳聚糖固体培养基上生长并形成水解圈的菌株，分别编号为S01、S02、 S03、S04。挑取纯化菌株接种于PHBV胶体壳聚糖固体平板培养基，30 ℃培养72 h后测量菌落直径（d）、水解圈直径（D），结果见表1。endprint

2.2菌株S03的分类鉴定

菌株S03的菌落形态不定型，培养初期菌丝呈白色，后转为灰白色至黑色，菌丝在培养基内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝。菌丝无隔、多核、分枝状，成熟菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。各分枝顶端着生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。这些性质与毛霉属（Mucor）微生物菌株的基本性质一致，依据Ainsworth分类系统初步鉴定菌株S03属于毛霉属。

2.3菌株S03生长曲线及培养时间对其产酶能力的影响

在微生物液体发酵过程中，为了高度积累目的产物，常须要掌握发酵代谢和酶活性的最旺盛时期，该时期也是高效积累产物的时期。微生物各生长阶段对目的产物都有重要影响，因此必须根据不同微生物生长特点，把其控制在有利于增加目的产物的最适条件下培养。由图1可知，从菌株S03的生长曲线和产酶时程来看，在培养1～6 d时菌株稳定生长，产酶高峰出现在培养3 d，此时壳聚糖酶活性达到1.37 U/mL。

2.4不同碳源对菌株 S03产壳聚糖酶的影响

不同碳源对菌株 S03产酶的影响见表2。壳聚糖酶包括组成型和诱导型，其中多数为诱导型。本研究中只有以壳聚糖或与其结构类似物作为碳源时才能诱导产酶，仅以蔗糖或葡萄糖为碳源菌株虽能生长良好却不能诱导产酶[7]。添加葡萄糖促进了酶活性的增长，说明菌株 S03产生的壳聚糖酶也属于诱导型壳聚糖酶；但葡萄糖添加过多，并不利于壳聚糖酶的产生。试验还发现，菌株S03在以甲壳质和壳聚糖为诱导物的培养基中产酶能力差别较大，表明该菌株为较专一的产壳聚糖酶菌株。

表2不同碳源对菌株S03产酶能力的影响

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末壳聚糖10.961%胶体壳聚糖11.391%甲壳质10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末壳聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5温度、pH值等发酵条件对产酶的影响

由图2可见，培养温度为28～30 ℃时，菌株S03产壳聚糖酶能力较高。

由图3可见，培养基起始pH值对产酶的影响比较明显，当pH值为5.5～6.5时菌株S03产酶能力较高，pH值为6.0时该菌产酶能力最强，酶活性最高。

3结论

本研究通过平板划线分离法筛选到4株产酶能力较强的菌株，在以壳聚糖为唯一碳源的培养基上均可产生明显的水解透明圈，其中菌株 S03产酶能力较强，系统分离鉴定表明

其属于毛霉属。在试验条件下菌株 S03产酶高峰出现在培养3 d时，在以粉末壳聚糖作为碳源的培养基中适量添加葡萄糖可以促进菌体增殖从而更利于产酶，说明该菌株产生的壳聚糖酶属于诱导酶。本研究为进一步开发利用微生物壳聚糖酶资源奠定了基础。

参考文献：

[1]戴芸，朱旭芬. 微生物壳聚糖酶的研究概况[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2004，30（2）：229-236.

[2]陈小娥，夏文水，余晓斌. 微生物壳聚糖酶研究进展[J]. 海洋科学，2004，28（3）：72-76.

[3]Tanaka T，Fujiwara S，Nishikori S，et al. A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5338-5344.

[4]Sugita A，Sugii A，Sato K，et al. Cloning and characterization of a gene coding for a major extracellular chitosanase from the koji mold Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2012，76（1）：193-195.

[5]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：58-91.

[6]张龙翔，张庭芳，李令媛. 生化试验方法和技术[M]. 2版.北京：高等教育出版社，1997：1-2.

[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.张红，沈永龙，黄金田，等. 几种池塘养殖模式对水体叶绿素a含量周年变化的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：349-350.endprint

2.2菌株S03的分类鉴定

菌株S03的菌落形态不定型，培养初期菌丝呈白色，后转为灰白色至黑色，菌丝在培养基内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝。菌丝无隔、多核、分枝状，成熟菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。各分枝顶端着生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。这些性质与毛霉属（Mucor）微生物菌株的基本性质一致，依据Ainsworth分类系统初步鉴定菌株S03属于毛霉属。

2.3菌株S03生长曲线及培养时间对其产酶能力的影响

在微生物液体发酵过程中，为了高度积累目的产物，常须要掌握发酵代谢和酶活性的最旺盛时期，该时期也是高效积累产物的时期。微生物各生长阶段对目的产物都有重要影响，因此必须根据不同微生物生长特点，把其控制在有利于增加目的产物的最适条件下培养。由图1可知，从菌株S03的生长曲线和产酶时程来看，在培养1～6 d时菌株稳定生长，产酶高峰出现在培养3 d，此时壳聚糖酶活性达到1.37 U/mL。

2.4不同碳源对菌株 S03产壳聚糖酶的影响

不同碳源对菌株 S03产酶的影响见表2。壳聚糖酶包括组成型和诱导型，其中多数为诱导型。本研究中只有以壳聚糖或与其结构类似物作为碳源时才能诱导产酶，仅以蔗糖或葡萄糖为碳源菌株虽能生长良好却不能诱导产酶[7]。添加葡萄糖促进了酶活性的增长，说明菌株 S03产生的壳聚糖酶也属于诱导型壳聚糖酶；但葡萄糖添加过多，并不利于壳聚糖酶的产生。试验还发现，菌株S03在以甲壳质和壳聚糖为诱导物的培养基中产酶能力差别较大，表明该菌株为较专一的产壳聚糖酶菌株。

表2不同碳源对菌株S03产酶能力的影响

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末壳聚糖10.961%胶体壳聚糖11.391%甲壳质10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末壳聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5温度、pH值等发酵条件对产酶的影响

由图2可见，培养温度为28～30 ℃时，菌株S03产壳聚糖酶能力较高。

由图3可见，培养基起始pH值对产酶的影响比较明显，当pH值为5.5～6.5时菌株S03产酶能力较高，pH值为6.0时该菌产酶能力最强，酶活性最高。

3结论

本研究通过平板划线分离法筛选到4株产酶能力较强的菌株，在以壳聚糖为唯一碳源的培养基上均可产生明显的水解透明圈，其中菌株 S03产酶能力较强，系统分离鉴定表明

其属于毛霉属。在试验条件下菌株 S03产酶高峰出现在培养3 d时，在以粉末壳聚糖作为碳源的培养基中适量添加葡萄糖可以促进菌体增殖从而更利于产酶，说明该菌株产生的壳聚糖酶属于诱导酶。本研究为进一步开发利用微生物壳聚糖酶资源奠定了基础。

参考文献：

[1]戴芸，朱旭芬. 微生物壳聚糖酶的研究概况[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2004，30（2）：229-236.

[2]陈小娥，夏文水，余晓斌. 微生物壳聚糖酶研究进展[J]. 海洋科学，2004，28（3）：72-76.

[3]Tanaka T，Fujiwara S，Nishikori S，et al. A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5338-5344.

[4]Sugita A，Sugii A，Sato K，et al. Cloning and characterization of a gene coding for a major extracellular chitosanase from the koji mold Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2012，76（1）：193-195.

[5]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：58-91.

[6]张龙翔，张庭芳，李令媛. 生化试验方法和技术[M]. 2版.北京：高等教育出版社，1997：1-2.

[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.张红，沈永龙，黄金田，等. 几种池塘养殖模式对水体叶绿素a含量周年变化的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：349-350.endprint

2.2菌株S03的分类鉴定

菌株S03的菌落形态不定型，培养初期菌丝呈白色，后转为灰白色至黑色，菌丝在培养基内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝。菌丝无隔、多核、分枝状，成熟菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。各分枝顶端着生球形孢子囊，孢囊孢子呈球形。这些性质与毛霉属（Mucor）微生物菌株的基本性质一致，依据Ainsworth分类系统初步鉴定菌株S03属于毛霉属。

2.3菌株S03生长曲线及培养时间对其产酶能力的影响

在微生物液体发酵过程中，为了高度积累目的产物，常须要掌握发酵代谢和酶活性的最旺盛时期，该时期也是高效积累产物的时期。微生物各生长阶段对目的产物都有重要影响，因此必须根据不同微生物生长特点，把其控制在有利于增加目的产物的最适条件下培养。由图1可知，从菌株S03的生长曲线和产酶时程来看，在培养1～6 d时菌株稳定生长，产酶高峰出现在培养3 d，此时壳聚糖酶活性达到1.37 U/mL。

2.4不同碳源对菌株 S03产壳聚糖酶的影响

不同碳源对菌株 S03产酶的影响见表2。壳聚糖酶包括组成型和诱导型，其中多数为诱导型。本研究中只有以壳聚糖或与其结构类似物作为碳源时才能诱导产酶，仅以蔗糖或葡萄糖为碳源菌株虽能生长良好却不能诱导产酶[7]。添加葡萄糖促进了酶活性的增长，说明菌株 S03产生的壳聚糖酶也属于诱导型壳聚糖酶；但葡萄糖添加过多，并不利于壳聚糖酶的产生。试验还发现，菌株S03在以甲壳质和壳聚糖为诱导物的培养基中产酶能力差别较大，表明该菌株为较专一的产壳聚糖酶菌株。

表2不同碳源对菌株S03产酶能力的影响

碳源1酶活性（U/mL）1%粉末壳聚糖10.961%胶体壳聚糖11.391%甲壳质10.501%葡萄糖10.001%蔗糖10.001%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖11.932%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖12.175%粉末壳聚糖+0.1%葡萄糖12.271%粉末壳聚糖+1%葡萄糖10.40

2.5温度、pH值等发酵条件对产酶的影响

由图2可见，培养温度为28～30 ℃时，菌株S03产壳聚糖酶能力较高。

由图3可见，培养基起始pH值对产酶的影响比较明显，当pH值为5.5～6.5时菌株S03产酶能力较高，pH值为6.0时该菌产酶能力最强，酶活性最高。

3结论

本研究通过平板划线分离法筛选到4株产酶能力较强的菌株，在以壳聚糖为唯一碳源的培养基上均可产生明显的水解透明圈，其中菌株 S03产酶能力较强，系统分离鉴定表明

其属于毛霉属。在试验条件下菌株 S03产酶高峰出现在培养3 d时，在以粉末壳聚糖作为碳源的培养基中适量添加葡萄糖可以促进菌体增殖从而更利于产酶，说明该菌株产生的壳聚糖酶属于诱导酶。本研究为进一步开发利用微生物壳聚糖酶资源奠定了基础。

参考文献：

[1]戴芸，朱旭芬. 微生物壳聚糖酶的研究概况[J]. 浙江大学学报：农业与生命科学版，2004，30（2）：229-236.

[2]陈小娥，夏文水，余晓斌. 微生物壳聚糖酶研究进展[J]. 海洋科学，2004，28（3）：72-76.

[3]Tanaka T，Fujiwara S，Nishikori S，et al. A unique chitinase with dual active sites and triple substrate binding sites from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1[J]. Applied and Environmental Microbiology，1999，65（12）：5338-5344.

[4]Sugita A，Sugii A，Sato K，et al. Cloning and characterization of a gene coding for a major extracellular chitosanase from the koji mold Aspergillus oryzae[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2012，76（1）：193-195.

[5]魏景超. 真菌鉴定手册[M]. 上海：上海科学技术出版社，1979：58-91.

[6]张龙翔，张庭芳，李令媛. 生化试验方法和技术[M]. 2版.北京：高等教育出版社，1997：1-2.

[7]Dhillon G S，Brar S K，Valero J R，et al. Bioproduction of hydrolytic enzymes using Apple pomace waste by A. niger：applications in biocontrol formulations and hydrolysis of chitin/chitosan[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（8）：1017-1026.张红，沈永龙，黄金田，等. 几种池塘养殖模式对水体叶绿素a含量周年变化的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（1）：349-350.endprint