基于FXR⁃FGF19通路研究益生菌对胆总管结石患者胆汁酸代谢的影响

背景：胆总管结石在取石术后有较高的复发率。近年研究表明肠道微生态失衡与胆固醇结石的形成有关。目的：探究益生菌干预对胆固醇结石高危人群血清脂多糖（LPS）以及胆汁酸代谢指标的影响。方法：选取2021年6月—2023年6月在石河子大学第一附属医院行ERCP取石术的胆总管结石患者60例，收集胆汁和粪便样本行细菌培养。将患者随机分为对照组和益生菌干预组，对照组取石术后予常规支持治疗，干预组在常规治疗的基础上服用双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊420 mg，每日2次，连续6个月。检测治疗前后革兰阴性菌细胞壁成分LPS、胆汁酸代谢关键分子成纤维细胞生长因子19（FGF19）和胆汁酸合成限速酶胆固醇7α⁃羟化酶（CYP7A1）血清水平的变化。结果：胆总管结石患者胆汁、粪便细菌培养显示主要致病菌为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。ERCP取石术后6个月，患者血清LPS、FGF19水平明显降低，CYP7A1水平明显升高（P均lt;0.05），益生菌干预组数据变化较对照组更为显著（P均lt;0.05）。结论：口服益生菌制剂可降低胆固醇结石高危人群的血清LPS水平，同时调节胆汁酸经肠肝循环代谢的经典通路法尼酯X受体（FXR）⁃FGF19通路，从而减少胆汁中的胆固醇过饱和，降低胆固醇结石的形成概率。

关键词 益生菌； 脂多糖类； 胆总管结石； 胆汁酸代谢； 法尼酯X受体； 胆固醇7⁃α⁃羟化酶

Effect of Probiotics on Bile Acid Metabolism via FXR⁃FGF19 Pathway in Patients With Choledocholithiasis YE Lüwang1， WANG Cong1， FAN Junwei1， JIANG Ting1， DU Mengyan1， CHEN Weigang2， LIU Fang2. 1Shihezi University School of Medicine， Shihezi， Xinjiang Uygur Autonomous Region （832002）; 2Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Shihezi University， Shihezi， Xinjiang Uygur Autonomous Region

Correspondence to： LIU Fang， Email： 18009935806@163.com

Background： Recurrence after stone removal is common in patients with choledocholithiasis. Recent studies have indicated that dysbiosis in gut microbiota plays an important role in the formation of cholesterol gallstones. Aims： To explore the effect of probiotics supplementation on serum lipopolysaccharide （LPS） and the indicators of bile acid metabolism in patients with a high risk of cholesterol gallstone formation. Methods： Sixty choledocholithiasis patients undergoing ERCP lithotomy were recruited at the First Affiliated Hospital of Shihezi University from June 2021 to June 2023. Bile and stool samples were collected for bacterial culture. Then the patients were randomly allocated into two groups：" patients in control group received conventional supportive therapy after calculus removal， while those in probiotics intervention group were given oral bifid triple viable enteric capsule 420 mg， twice a day for 6 months based on conventional therapy. Changes in serum levels of LPS， the cell wall component of Gram⁃negative bacteria， fibroblast growth factor 19 （FGF19）， the key molecule in bile acid metabolism， and cholesterol 7α⁃hydroxylase （CYP7A1）， the rate⁃limiting enzyme of bile acid synthesis， were determined and compared between the two groups. Results： Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were the main pathogens in bile and stool of patients with choledocholithiasis. Six months after ERCP lithotomy， the serum levels of LPS and FGF19 were decreased， and the serum level of CYP7A1 was increased in both groups （all Plt;0.05）， especially in probiotics intervention group （all Plt;0.05）. Conclusions： Oral probiotics supplementation can reduce the serum LPS level and modulate the canonical pathway of enterohepatic circulation of bile acids ⁃⁃ farnesoid X receptor （FXR）⁃FGF19 pathway in high⁃risk patients of cholesterol gallstone formation. These alterations reduce the cholesterol supersaturation in bile and inhibit the probability of cholesterol gallstone formation.

Key words Probiotics; Lipopolysaccharides; Choledocholithiasis; Bile Acid Metabolism; Farnesoid X Receptor; Cholesterol 7⁃alpha⁃Hydroxylase

胆石症在全球范围内十分普遍，我国报道的成人胆囊结石患病率为2.3%～6.5%，其中70%以上为胆固醇结石[1]。胆总管结石多继发于胆囊结石，结石系从胆囊脱落至胆总管，内镜取石术后复发率高达12.4%[2]，且通常会诱发急性胆管炎、急性胆源性胰腺炎，该类患者也是胆固醇结石再次形成的高危人群。胆汁中胆固醇过饱和是胆固醇结石形成的前提，胆固醇在肝脏中经关键限速酶胆固醇7α⁃羟化酶[cholesterol 7α⁃hydroxylase，又称细胞色素P450 7A1酶（cytochrome P450 7A1， CYP7A1）]的作用和一系列生物学转化过程分解为胆汁酸，随胆汁排入肠道，并在肠道内被重吸收入肝，这一胆汁酸肠肝循环受多种因素调节，其中以法尼酯X受体（farnesoid X receptor， FXR）⁃成纤维细胞生长因子19（fibroblast growth factor 19， FGF19）通路最为经典[3]，干预和调控CYP7A1以及FXR⁃FGF19通路是胆汁酸代谢的研究热点。

近年研究[4]表明，胆总管结石患者的肠道微生态改变表现为菌群多样性减少、结构失调，以大肠埃希菌为代表的革兰阴性杆菌丰度增加。肠道微生态失衡可影响胆汁酸和胆固醇代谢，与胆固醇结石的形成密切相关[5⁃6]，但相应环节之间的关联以及具体机制尚不明确。脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）是革兰阴性菌细胞壁的主要成分和毒力因子，被认为与感染严重程度呈正相关。一些研究指出，在肥胖等代谢相关疾病中，补充益生菌可通过调节肠道菌群改善肠道通透性，降低循环血LPS含量[7]。本研究分析了胆总管结石患者胆汁和粪便主体菌属的关联，观察内镜取石术后补充益生菌制剂患者的血清LPS以及FGF19、CYP7A1水平变化，探究益生菌干预是否能对LPS以及胆汁酸代谢指标产生影响，以期为预防胆固醇结石的形成提供临床数据。

对象与方法

一、研究对象

连续纳入2021年6月—2023年6月期间就诊于石河子大学第一附属医院，确诊为胆总管结石并经内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）一次性取石成功的患者。排除标准：①患者明确拒绝入组；②严重术中、术后并发症；③严重心、肾功能不全，合并恶性肿瘤，合并其他严重胆道疾病；④入组前2周接受过抗菌药物治疗；⑤ERCP术未完全取出胆管结石，或术中植入胆管支架。最终共60例胆总管结石患者纳入研究，采用随机数字表法分为益生菌干预组和对照组，每组30例。研究通过石河子大学第一附属医院医学伦理委员会批准（批件号：KJX2022⁃056⁃01），入组患者均签署知情同意书。

二、方法

1. 胆汁、粪便样本收集和细菌培养：于ERCP术中收集胆汁标本，于益生菌干预前收集粪便标本（2 g），进行细菌培养。粪便标本暂存于无菌容器内，稀释后接种于培养基上，胆汁标本则直接接种于培养基上，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h。以接种环挑取单个菌落，染色后于光学显微镜下鉴定菌种。

2. 益生菌干预：对照组ERCP取石术后予常规支持治疗，干预组在常规治疗的基础上联合口服双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊（贝飞达®，210 mg/粒，每克含长型双歧杆菌≥1.0×106 CFU，嗜酸乳杆菌≥1.0×106 CFU，粪肠球菌≥1.0×106 CFU；晋城海斯制药有限公司，国药准字S19993065）420 mg，每日2次，连续服用6个月。

3. 血清LPS、FGF19、CYP7A1水平测定：分别于ERCP取石术前和术后6个月收集血清标本，采用ELISA法检测LPS、FGF19、CYP7A1水平，操作步骤参照试剂盒（CUSABIO TECHNOLOGY LLC）说明书。

三、统计学分析

应用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布者以x±s描述，两组间比较采用独立样本t检验或配对t检验，不符合正态分布者以M（P25， P75）描述，两组间比较采用Mann⁃Whitney U检验或Wilcoxon符号秩和检验；计数资料以例数和（或）百分率描述，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。Plt;0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

对照组30例患者中，男性18例，女性12例，平均年龄（69.50±13.38）岁；干预组30例患者中，男性17例，女性13例，平均年龄（71.87±9.71）岁。两组性别构成、年龄差异均无统计学意义（P均gt;0.05）。

二、胆汁和粪便细菌培养结果

胆汁细菌培养检出例数居前3位的细菌为大肠埃希菌（19例）、粪肠球菌（16例）和肺炎克雷伯菌（15例），阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鹑鸡肠球菌、变形杆菌检出例数均为3例。5例患者胆汁培养结果为阴性，16例患者胆汁中培养出2种细菌。

粪便细菌培养共检出6种细菌，分别为大肠埃希菌（30例）、粪肠球菌（20例）、肺炎克雷伯菌（10例）、变形杆菌（5例）、头状葡萄球菌（2例）和铜绿假单胞菌（1例）。18例患者粪便培养结果为阴性，23例患者至少培养出2种细菌。胆汁细菌培养检出例数居前5位的菌种与粪便细菌培养一致（图1）。

二、血清LPS、FGF19、CYP7A1水平

ERCP取石术前，干预组与对照组血清LPS水平差异无统计学意义（P=0.05）；取石术后6个月，两组LPS水平均较治疗前明显降低（P均lt;0.01），干预组下降更为显著，与同时点对照组相比差异有统计学意义（Plt;0.01；表1、图2A）。

ERCP取石术前，干预组与对照组血清FGF19、CYP7A1水平差异无统计学意义（P=0.05， P=0.86）；取石术后6个月，两组FGF19水平较治疗前明显降低，CYP7A1水平较治疗前明显升高（P均lt;0.01），干预组数据变化更为显著，与同时点对照组相比差异有统计学意义（P均lt;0.01；表1、图2B、2C）。

讨 论

肠道菌群及其代谢产物所构成的微生态环境对宿主的营养和药物代谢、病原体抵抗，以及肠黏膜屏障结构的完整性和肠道免疫稳态的维持具有至关重要的作用，健康的肠道微生态与宿主整体健康密切相关[8⁃9]。已有研究表明肠道微生态失衡参与了胆固醇结石的形成[3⁃6]，本研究拟分析胆总管结石患者肠道菌群结构的变化以及益生菌干预对胆汁酸代谢的影响。研究收集胆总管结石患者的胆汁和粪便标本进行细菌培养，结果显示两种标本中的致病菌均以革兰阴性杆菌大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主。Lyu等[10]的研究收集胆总管结石患者的胆汁和十二指肠液行16S rRNA高通量测序，发现十二指肠埃希菌属⁃志贺菌丰度显著增加，与本研究发现相一致。大肠埃希菌属于变形菌门，为革兰阴性杆菌，而变形菌门丰度增加是肠道微生态失衡和相关疾病风险的标志之一[11]。我国学者对胆总管结石合并胆管炎患者肠道微生态的宏基因组测序分析也发现，患者胆汁培养可检出大肠埃希菌、产酸克雷伯菌等多种致病菌，肠道中未分类肠杆菌科、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌等的丰度较健康人显著增加[4]。新近动物实验结果显示，以胆固醇结石患者为供体的粪菌移植在常规饮食饲养的无胆石小鼠中可诱导胆固醇结石形成，未行粪菌移植的小鼠则无结石形成[12]。综合上述研究结果，推测肠道菌群与胆总管结石合并胆道感染相关，且以变形菌门革兰阴性杆菌为主，革兰阴性杆菌在胆固醇结石的形成中起有重要作用。

LPS是肠道革兰阴性杆菌致病过程中的关键分子，其为革兰阴性菌的细胞壁成分，可通过激活Toll样受体（Toll⁃like receptor 4， TLR4）触发机体免疫应答，可激活丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen⁃activated protein kinase， MAPK）、核因子⁃κB（nuclear factor⁃κB， NF⁃κB）等免疫炎症信号通路，上调白细胞介素⁃1（interleukin⁃1， IL⁃1）、IL⁃6、肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α， TNF⁃α）等促炎细胞因子表达，与肠道细菌感染相关脓毒症、脓毒性休克、多器官衰竭，以及炎症性肠病等非感染性肠道炎症的发生、发展有关，并可通过肠肝轴参与肝脏炎症损伤的发生[13⁃14]。有研究发现LPS可降低肠道菌群多样性，并导致肠道相关淋巴组织中调节性T细胞数量减少，Th17、Th1细胞数量增加[13]。牛昊书等[15]探讨了脂多糖与胆总管结石形成的关系，指出LPS可通过与TLR4结合，激活细胞内MAPKs⁃NF⁃κB信号通路，产生炎症级联反应，最终促进胆石形成。本研究纳入的胆总管结石患者胆汁和粪便细菌培养结果均为以大肠埃希菌为代表的革兰阴性杆菌为主，血清LPS水平呈升高状态，结合上述研究结果，推测LPS增加与肠道内革兰阴性杆菌丰度增加有关。

益生菌是一类对健康有益的活性微生物，可通过形成酸性环境、竞争结合位点、破坏病原菌结构以及合成抑菌物质等方式调节肠道菌群，维持肠道微生态稳定，通过增强肠道化学屏障、机械屏障、生物屏障、免疫屏障等提高肠道防御能力[16]。既往研究表明，补充益生菌制剂可改善女性绝经后肥胖[17]以及自身免疫性肝炎[18]、胆总管结石[15]等多种疾病状态下的LPS水平升高。本研究予ERCP取石术后胆总管结石患者双歧杆菌三联活菌肠溶胶囊干预6个月，亦观察到血清LPS水平显著降低，且降幅明显高于单纯行ERCP取石术者，证明益生菌制剂可用于胆固醇结石复发高危患者的治疗，对于降低血清LPS水平具有积极作用。

CYP7A1是肝细胞以胆固醇为原料合成胆汁酸的关键限速酶，其活性受抑可致胆固醇分解代谢受阻，胆汁中胆固醇过饱和是胆固醇结石形成的必要条件；包括不同核受体和调节因子在内的多种机制参与了CYP7A1的表达调控[19⁃20]。胆汁酸受体核受体FXR相关通路是调节胆汁酸代谢最为经典的通路：一方面，肝脏中的FXR通过诱导产生小异二聚体分子伴侣（small heterodimer partner， SHP）、转录激活因子肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α， HNF4α），抑制肝受体同源物⁃1（liver receptor homolog⁃1， LRH⁃1）而抑制CYP7A1表达，影响胆固醇分解代谢；另一方面，肠道中的FXR可诱导肠上皮细胞分泌FGF19，后者进入肠系膜静脉和门静脉，与肝细胞表面的成纤维细胞生长因子受体4（fibroblast growth factor receptor 4， FGFR4）/β⁃klotho异二聚体结合，与SHP共同作用，下调CYP7A1表达[3]。Ye等[21]的实验研究显示，乳酸菌制剂可改善致石饮食引起的肠道微生态失衡，通过激活FXR增加小鼠回肠FGF15（人FGF19同源物）和肝细胞FGFR4、SHP表达，进而抑制CYP7A1表达，调节胆汁酸代谢，减少胆固醇结石的形成。本研究结果表明，胆总管结石患者的血清FGF19水平在ERCP取石术后显著降低，同时血清CYP7A1水平升高，接受益生菌干预者两者变化更为显著。推测益生菌干预系通过调节肠道微生态、减少肠道革兰阴性杆菌丰度而降低LPS水平，并对调节胆汁酸代谢的FXR⁃FGF19通路以及CYP7A1表达产生影响。

综上所述，本研究发现口服益生菌制剂可降低胆固醇结石高危人群的血清LPS水平，同时调节胆汁酸经肠肝循环代谢的经典通路FXR⁃FGF19通路，从而减少胆汁中的胆固醇过饱和，降低胆固醇结石的形成概率。LPS作为革兰阴性菌细胞壁的主体成分，可能成为研究调节肠道菌群干预胆汁酸代谢的新靶点，为探究胆汁酸代谢的各调节通路，以及开展益生菌抑制胆固醇结石成石的机制研究提供帮助。本研究为单中心小样本研究，因患者依从性低而未能进行益生菌干预后的胆汁和粪便细菌培养，亦未能行机制研究。后续拟开展大样本多中心研究，提高患者依从性，增加益生菌干预种类并设计动物实验，以进一步深入探讨益生菌降低ERCP取石术后胆总管结石复发率的相关机制。

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（本文编辑：蒋晓玲）

*基金项目：新疆生产建设兵团指导性科技计划项目（2022ZD086， 2023ZD006）；石河子大学自主资助支持校级科研项目（ZZZC202197）；石河子大学第一附属医院院级科研项目（ZD201903）#Email： 1107505466@qq.com

amp;本文通信作者，Email： 18009935806@163.com