生姜青枯病菌拮抗芽孢杆菌的筛选、鉴定及发酵条件优化

摘要：【目的】筛选出对生姜青枯病病原菌具有较好拮抗效果的芽孢杆菌，并优化其发酵条件，旨在为丰富生姜青枯病的生防芽孢杆菌菌种资源及生防制剂的进一步开发应用打下理论基础。【方法】以生姜根际土壤为研究对象，以生姜青枯病菌为靶标，通过稀释涂布法和抑菌圈法从中分离并筛选出能高效拮抗生姜青枯病菌的芽孢杆菌；通过形态学观察、生理生化测定和分子生物学鉴定，确定拮抗菌株的分类地位；采用牛津杯法测定拮抗菌株对生姜青枯病菌的抑菌活性，并结合单因素和正交试验对其发酵条件进行优化。【结果】从生姜根际土壤中分离出1株对生姜青枯病菌具有较强拮抗作用的菌株HC-5，其抑菌圈直径达0.71 cm。综合形态学特征、生理生化特性及分子鉴定结果，将菌株HC-5鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。单因素和正交试验结果显示，菌株HC-5的最适发酵培养基组分为糯米粉5.0 g/L、酵母浸粉7.0 g/L、硫酸锌11.0 g/L，最适发酵条件为培养温度35℃、培养时间36 h、接种量1.0%、转速180 r/min、初始pH 5.5、装液量100 mL。优化后菌株HC-5无菌上清液对生姜青枯病菌的抑菌圈直径增大至3.03 cm，相比于LB和发酵培养基条件下分别增大76.2%和62.9%。【结论】菌株HC-5对生姜青枯病菌具有良好的拮抗效果，经发酵条件优化后其无菌上清液对生姜青枯病菌的抑菌活性显著增强。菌株HC-5具有开发成生姜青枯病生防菌剂的潜力。

关键词：生姜；青枯病；贝莱斯芽孢杆菌；拮抗活性；正交试验；发酵条件

中图分类号：S435.67文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）02-0468-11

Screening，identification and optimization of fermentation con-ditions for Bacillus antagonistic against Ralstonia solanacearum

CUI Wen-yan'，ZHANG Jia-jia¹，YU Ling-li¹，ZHANG Gui-yun'，WANG Wen-jia¹，PENG Ling'，LUO Xi-yan¹，HE Peng-jie¹，2（'Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550025，China;²Key Laboratory of Green "Pesticide and Agricultural Bioengineering，Ministry of Education，Guizhou University，Guiyang， Guizhou 550025，China）

Abstract：[Objective]This study aimed to identify Bacillzs strains that showed effective antagonistic activity against "the ginger bacterial wilt causative pathogen Ralstonia solanacearum，and to optimize the fermentationconditions of these "strains，thereby providing theoretical foundation for enriching the resources of biocontrol Bacillus strains and further de-veloping and applying biocontrol agents for ginger wilt disease.【Method】Gingerrhizosphere soil samples were research object，ginger R.solanacearum strains were targets，dilution coating method and antibacterial circle method wereem-ployed to screen strains exhibitingpotent antagonistic effects against R.solanacearum.Antagonistic strains were then clas-sified based on morphological observations，physiological and biochemical testing，as well as molecular biological identi-fication.The antibacterial activity of the selected strains against R.solanacearum was quantified using the Oxford cup method.Subsequently，both single-factor and orthogonal experiments were conducted to refine their fermentation condi tions.[Result]Strain HC-5，isolated from the ginger rhizosphere soil and exhibiting strong antagonistic properties against R.solanacearum formed an inhibition zone of 0.71 cm in diameter.Integratingmorphological features，physiological and biochemical characteristics and molecular identification results，HC-5 was classified as Bacillus velezensis.The results of single factor and orthogonal experiments showed that，optimal growth medium for strain HC-5 was established to contain glutinous rice four（5.0 g/L），yeast extract（7.0 g/L），and zinc sulfate（11.0 g/L）.The best fermentation conditions were determined as temperature of 35℃，fermentation duration of 36 h，inoculation amount of 1.0%，rotation speed of 180 r/min，initial pH of 5.5 and liquid volume of 100 mL.The diameter of theantibacterial zone of the sterile supernatant of the optimized strain HC-5 against R.solanacearum increased to 3.03 cm，which was 76.2%and 62.9%larger than under LB and fermentation medium conditions，respectively.【Conclusion】Strain HC-5 demonstrates asubstantial antagonistic effect against R.solanacearum.The enhanced antibacterial activity of its sterile supernatant following fermentation condi-tion optimization suggestsits potential asa biocontrol agent incombatingginger bacterial wilt.

Keywords：ginger;bacterial wilt;Bacillus velezensis;antagonistic activity;orthogonal test;fermentation condition

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32160671）;GuizhouBasic Research Plan Project（QKHJC-ZK〔2021〕Yiban 147）;Guizhou Science and Technology Support Project（QKHZC[2020]4Y109）;Doctoral Startup Foundation of Guizhou Universityof TraditionalChinese Medicine（GZYBSQD〔2020〕20）

0引言

【研究意义】生姜（Zingiber officinale Roscoe）为姜科姜属多年生草本植物，在我国栽培历史悠久，是我国最重要的药食两用作物之一（汪茜等，2023），主产于贵州、湖北和四川等地。生姜既是一种重要的香辛调味品，也是一种重要的中药材，广泛应用于食品、医药和保健等领域。据传统中医理论，生姜性辛温、入中焦，能散寒温中；现代医学研究也发现，生姜具有抗氧化、抗炎、抗菌和调节中枢神经等多种功效（Mao et al.，2019），对心脏、肾等器官有较好的保护作用，有助于缓解胃肠痉挛、降低血压等（李录久等，2009）。近年来，随着国内外市场对生姜需求的增长，生姜在我国的种植面积不断扩大。然而，由于其无性繁殖特性和重茬种植习惯，生姜在整个栽培过程中极易受到病虫害的侵染，严重影响生姜的产量与品质（周弦等，2022）。其中，由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacarum）引起的青枯病是生姜生产中最严重的一种土传病害（Prameela and Suseela，2020），该病害破坏性极大，一旦发生，可造成植株茎、叶及根茎腐烂，严重时甚至整株死亡，导致产量减少30%～70%以上，甚至绝收（Jiang et al.，2017）。目前，生姜青枯病的防治主要依赖于化学防治，但多数化学药剂不仅防效有限，且大范围、长期施用后还可能引发病菌耐药性、环境污染、药物残留和根际微生态破坏等问题（Jiang et al.，2017）。相比之下，以施用微生物菌剂为代表的生物防治不仅能有效防控病害，还具有选择性强、绿色环保等优点（Inoue et al.，2022）。因此，筛选适用于生姜青枯病的生防菌株并优化其发酵条件，对生姜产业的高质量和可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】芽孢杆菌（Bacillus spp.）是一类重要的生防细菌，具有良好的防病、促生功效，是目前应用最广泛的生防菌种资源之一（Chowdhury et al.，2015）。近年来，芽孢杆菌因其环境友好、安全无毒等优点被大量应用于农业生产中，在防控植物病害等方面取得了良好效果。江欢欢等（2010）从辣椒根际土壤中分离筛选到1株对辣椒青枯病菌具有良好拮抗效果的生防菌株a 45，经鉴定为枯草芽孢杆菌（B.subtilis）。何朋杰等（2019）研究证实，枯草芽孢杆菌XF-1施用后能高效定殖入大白菜的根、茎、叶等组织内，进而抑制根肿病病原菌的侵染和病害发生。要雅倩等（2020）从江苏泗洪桃园发病土壤中筛选出1株解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）T-6，该菌株不但能有效防控桃树根腐病，还兼具有良好的溶磷、解钾能力。刘博等（2022）研究发现，枯草芽孢杆菌LJ3-1发酵液对紫花苜蓿根腐病病原菌（Fusarium avenaceum）具有良好的拮抗效果。王飞等（2023）从健康丹参根际土壤中分离获得1株贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）Bv 1-4，研究后证实其对丹参根腐病菌菌丝生长具有显著的抑制作用。祝文慧等（2023）研究发现，贝莱斯芽孢杆菌LYK10和蜡样芽孢杆菌（B.cereus）QTK2等浓度混合浸种后对辣椒疫病的防效较任一单菌处理提高27.78%～42.45%。生防菌能否转化为产品并应用常受到多种因素的影响，而发酵是一个重要的影响环节。在微生物发酵过程中，培养基配方和发酵条件对其生长速度、菌体量及抑菌活性等均具有显著影响。乔佳慧子等（2022）通过响应面法对生防菌E20303发酵配方及发酵条件进行优化，优化后其对马铃薯干腐病病原菌的抑菌率由51.15%提高至72.51%。刘芳等（2023）报道贝莱斯芽孢杆菌YC11菌株发酵液培养基优化后对烟草黑胫病的防效可达到100%。近年来，有关芽孢杆菌发酵条件优化的报道较多，但不同菌株的最佳发酵条件存在较大差异。以pH和发酵时间为例，王冲等（2023）研究发现，贝莱斯芽孢杆菌Vel-HNGD-F2的最佳发酵条件为初始pH 7.14、培养时间72h;王书翰等（2023）报道解淀粉芽孢杆菌YB114的最佳发酵条件为初始pH 7.0、发酵时间24 h，优化发酵条件后YB114对棒孢叶斑病的防效提升了22.4%;申云鑫等（2024）发现贝莱斯芽孢杆菌SH-1471的最适发酵条件为pH 7.5、培养时间20～24 h。【本研究切入点】植物根际生境由于生态环境相对稳定且营养物质较丰富，使得芽孢杆菌等益生菌大量聚集，这些芽孢杆菌与青枯病菌在生态位上相近，存在竞争关系，从而为筛选出高效拮抗青枯病菌的生防菌株提供了有利条件。然而，目前关于利用生姜根际芽孢杆菌拮抗生姜青枯病菌的研究报道较少。【拟解决的关键问题】以生姜根际土壤为研究对象，以生姜青枯病菌为靶标，通过稀释涂布法和抑菌圈法从中分离并筛选出能高效拮抗生姜青枯病菌的芽孢杆菌，对筛选出的菌株进行分类鉴定并优化其发酵条件，以提高其抑菌效果，旨在为丰富生姜青枯病的生防芽孢杆菌菌种资源及生防制剂的进一步开发应用打下理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1土壤样品土壤样品采自贵州省黔南布依苗族自治州惠水县生姜青枯病绿色防控基地试验地（26°02'N，106°64'E，海拔760 m）。采用5点取样法，随机选取5株健康生姜植株，拔起后采集其根际土壤，装入自封套袋中带回实验室，于4℃下保存备用。

1.1.2供试病原细菌生姜青枯病病原菌青枯劳尔氏菌（以下简称青枯菌）由贵州中医药大学中药材病害防控实验室分离并保存。

1.1.3供试培养基LB培养基：蛋白胨10.0g/L、氯化钠7.5 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、琼脂18.0 g/L，pH自然，121℃灭菌30 min。发酵培养基：酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、氯化钠10.0 g/L，pH 7.0，121℃高温灭菌30 min

1.2拮抗芽孢杆菌的分离与筛选

1.2.1生姜根际芽孢杆菌分离采用稀释涂布法分离芽孢杆菌。称取5g生姜根际土壤放入预先装有45 mL无菌水的组培瓶中，将组培瓶置于恒温摇床37℃下170 r/min振荡10 min制得土壤悬浮液；将含有土壤悬浮液的组培瓶转移至恒温水浴锅，90℃下静置10 min，用无菌水对土壤悬浮液进行100和1000倍梯度稀释，取稀释液涂布在LB培养基上，并在37℃下倒置培养24 h。待LB培养基上长出细菌菌落后，将具有典型芽孢杆菌菌落特征的单菌落转移至新的LB培养基上划线纯化（He et al.，2022）。挑取单菌落于LB液体培养基中37℃下170 r/min振荡培养48 h。培养结束后，将培养物与40%甘油按1：1的比例混合均匀，置于-20℃保存备用。

1.2.2拮抗芽孢杆菌筛选采用抑菌圈法筛选拮抗菌株。将保存的芽孢杆菌活化后接种至液体LB 培养基中，37℃下170 r/min振荡培养48 h，调节菌液ODo为1.0。将青枯菌接种至LB液体培养基中，30℃下170 r/min振荡培养24 h，调节菌液OD₆为2.0。将固体LB培养基加热至溶解状态，待温度降至约50℃时按1：200的比例加入青枯菌菌液，充分摇匀后倒板。待培养基凝固后，吸取2μL各芽孢杆菌菌液点接在培养基上，于28℃下静置培养24 h。培养结束后，观察并测量抑菌圈的形成情况和直径，选取抑菌效果最好的拮抗菌株用于后续试验。

1.3拮抗菌株鉴定

1.3.1形态学观察参照Cui等（2019）的方法，观察拮抗菌株在LB培养基上的菌落形态、大小和颜色；分别使用革兰氏染色液试剂盒和芽孢染色液试剂盒对拮抗菌株进行革兰氏和芽孢染色，然后通过光学显微镜观察染色结果，分析拮抗菌株的菌体和芽孢的形态与大小。

1.3.2生理生化测定参照He等（2022）的方法开展生理生化鉴定。主要开展V-P试验、过氧化氢酶试验、明胶水解、厌氧生长、尿素利用和不同碳源利用等试验。

1.3.3分子生物学鉴定使用生工生物工程（上海）股份有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取拮抗菌株基因组DNA，以其基因组DNA为模板，以细菌16S rRNA基因通用引物对PO/P6（5'-GAAG AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，5'-CTACGGCTACC TTGTTACGA-3'）及rpoB基因引物对rpoB-F/R（5'-T GTAAAACGACGGCCAGTCC-3'，5'-AGCGGATAA CAATTTCACACAGG-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系20.0μL：2×Tag DNA模板0.5μL，PCR Master-Mix 10.0 pL，上、下游引物各1.0μL，ddH₂O 7.5pL。扩增程序：94℃预变性4 min 30s;94℃40 s，53℃45 s，72℃80 s，进行30个循环；72℃延伸10 min。rpoB基因的PCR扩增程序与16S rRNA基因相似，但退火温度调整为60℃。PCR反应结束后，取样进行琼脂糖凝胶电泳检测。将电泳检测合格的扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。将测序得到的序列结果用DNAMAN软件拼接后输入到NCBI数据库中，应用BLASTN程序与数据库中已有序列进行同源性比对。根据比对结果，下载同源性相近代表性菌株序列，使用MEGA 7.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树（Kumar et al.，2016）。

1.4拮抗菌株无菌上清液制备及其抑菌活性测定

1.4.1拮抗菌株无菌上清液制备将活化好的拮抗菌株以0.5%的接种量接种于各供试培养基中，30℃下170 r/min振荡培养48 h。取发酵液于4℃下10000 r/min离心5 min，取上清液通过0.22μm的滤膜过滤，即制得拮抗菌株无菌上清液。

1.4.2抑菌活性测定采用牛津杯法测定拮抗菌株无菌上清液对青枯菌的抑菌活性。在距离混有青枯菌的LB培养基中央的上下左右各2.5 cm处放置4个牛津杯，然后向每个牛津杯中加入200μL拮抗菌株无菌上清液，28℃恒温静置培养48 h后观察抑菌圈的形成情况，测量抑菌圈直径。每处理3次重复。

1.5培养基组分优化

1.5.1碳源优化向发酵培养基中分别加入5.0 g/L的蔗糖、甘露醇、玉米淀粉、麦芽糖、可溶性淀粉、糯米粉和小麦淀粉替代原有碳源，其他组分保持不变。采用牛津杯法测定不同处理下拮抗菌株无菌上清液对青枯菌的拮抗活性，以确定最佳碳源。

1.5.2氮源优化向发酵培养基中分别加入5.0 g/L的蛋白胨、尿素、胰蛋白胨、甘氨酸、牛肉膏、氯化铵和硫酸铵替代原有氮源，其他组分保持不变。试验方法同1.5.1。

1.5.3无机盐优化向发酵培养基中分别加入10.0 g/L的碳酸钙、硫酸镁、磷酸二氢钠、硫酸锌、氯化钾、氯化镁和磷酸二氢钠替代原有无机盐，其他组分保持不变。试验方法同1.5.1。

1.5.4碳源、氮源和无机盐最佳浓度单因素试验

根据最佳碳源、氮源和无机盐筛选结果，进一步开展以上3种组分最佳浓度的单因素试验。在保持另外2种组分不变的条件下，分别往发酵培养基中加入不同浓度（1.0、3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0和15.0 g/L）的最佳碳源、氮源及无机盐以替代原有的相应组分。采用牛津杯法测定不同处理下拮抗菌株无菌上清液对青枯菌的拮抗活性，以初步确定最佳碳源、氮源和无机盐的最适浓度。

1.5.5培养基组分正交试验选择最佳碳源、氮源和无机盐作为培养基组分，根据单因素试验结果，设计3因素3水平正交试验，以确定培养基组分的最佳配比。

1.6发酵条件优化

1.6.1培养温度、发酵时间和接种量单因素试验采用优化后的培养基配方，对培养温度（20、25、30、35和40℃）、接种量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%）及发酵时间（12、24、36、48、60和72 h）进行单因素试验。采用牛津杯法测定不同条件下拮抗菌株无菌上清液对青枯菌的拮抗活性，以初步确定最适培养温度、发酵时间和接种量。

1.6.2培养温度、发酵时间及接种量正交试验根据培养温度、发酵时间和接种量的单因素试验结果，设计3因素3水平正交试验，以确定3个因素的最优组合。

1.6.3摇床转速、初始pH和装液量单因素试验

采用优化后的培养基配方，并结合最佳培养温度、接种量和发酵时间条件，进一步对摇床转速（120、150、180、210和240 r/min）、初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5）和装液量（300 mL锥形瓶中装液量，下同）（60、80、100、120、140和160 mL）进行单因素试验。采用牛津杯法测定不同条件下拮抗菌株无菌上清液对青枯菌的拮抗活性，以初步确定最适摇床转速、初始pH及装液量。

1.6.4摇床转速、装液量及初始pH正交试验根据摇床转速、初始pH及装液量的单因素试验结果，设计3因素3水平正交试验，以确定3个因素的最优组合。

1.7平板抑菌活性验证

按照1.4.1的方法，以0.5%比例将拮抗菌株分别接种至LB和发酵培养基中，30℃下170 r/min振荡培养48 h;或以1.0%比例将拮抗菌株接种至本研究优化后的培养基中于优化后的发酵条件下振荡培养36 h;培养结束后，制备相应的无菌上清液。采用牛津杯法检测各无菌上清液对青枯菌的抑菌活性。

1.8统计分析

采用Excel 2019对试验数据进行处理，通过DPS 7.05进行正交试验设计和数据统计分析。

2结果与分析

2.1拮抗芽孢杆菌的分离与筛选结果

通过梯度稀释涂布法从生姜根际土壤中分离得到307株芽孢杆菌。利用抑菌圈法评估307株芽孢杆菌对青枯菌的拮抗效果，发现菌株HC-5的抑菌效果最佳，其抑菌圈直径达0.71±0.01 cm（图1），因此，选取菌株HC-5进行后续研究。

2.2菌株HC-5鉴定

2.2.1形态学特征在LB培养基上培养24 h后，菌株HC-5单菌落呈乳白色，边缘不规则，有黏性，不透明，表面粗糙，有皱褶（图2-A）。菌株HC-5革兰氏染色结果呈阳性，其菌体呈杆状，大小为1.1～3.1μm×0.5～0.8μm（图2-B）;经芽孢染色后，可在光学显微镜下观察到椭圆形绿色芽孢，大小为0.9～1.6μm×0.3～1.0μm（图2-C）。

2.2.2生理生化特性生理生化试验结果（表1）显示，菌株HC-5为兼性需氧菌，硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、过氧化氢试验、甲基红试验、V-P试验、产吲哚乙酸试验等均为阳性，尿素利用试验呈阴性，能水解淀粉、明胶，可耐受10%NaCl，在5℃环境无法生长，可利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇、乳糖等多种碳源，与贝莱斯芽孢杆菌相似。

2.2.3分子生物学鉴定将菌株HC-5测序结果输入到DNAMAN中进行拼接，结果显示，经PCR扩增获得的菌株HC-5的16S rRNA和rpoB基因片段长度分别为1420和1089 bp。将拼接结果分别输入到NCBI数据库进行BLASTN比对，结果显示与贝莱斯芽孢杆菌的同源性均达99%。根据比对结果，选取并下载同源性较高的菌株序列，按照16S rRNA-rpoB的顺序拼接，通过MEGA 7.0的邻接法构建系统发育进化树，结果（图3）显示，菌株HC-5与贝莱斯芽孢杆菌HC-8的遗传距离最近，聚为一类。综合形态学、生理生化特征及分子生物学鉴定结果，确定菌株HC-5为贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）。

2.3菌株HC-5培养基优化结果

2.3.1碳源、氮源和无机盐对菌株HC-5拮抗效果的影响在不同碳源、氮源和无机盐条件下菌株HC-5的无菌上清液对青枯菌的拮抗活性存在显著差异。其中，以糯米粉作为碳源时菌株HC-5的无菌上清液对青枯菌的抑菌圈直径为2.17 cm，显著大于其他7种碳源处理（Plt;0.05，下同）（图4）;以酵母浸粉为氮源时菌株HC-5的无菌上清液对青枯菌的抑菌圈直径为1.94 cm，显著大于其他7种氮源处理（图5）;以硫酸锌为无机盐时菌株HC-5的无菌上清液对青枯菌的抑菌圈直径为2.70 cm，显著大于其他7种无机盐处理（图6）。因此，选择糯米粉为最佳碳源、酵母浸粉为最佳氮源、硫酸锌为最佳无机盐。

2.3.2碳源、氮源和无机盐单因素试验结果单因素试验结果（图7）显示，以糯米粉、酵母浸粉和硫酸锌作为培养基组分时，任意单一组分浓度的变化均显著影响菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的拮抗效果，随着糯米粉、酵母浸粉和硫酸锌浓度的升高，菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的拮抗活性均呈先升高后降低的变化趋势，其中，当糯米粉、酵母浸粉和硫酸锌浓度分别为7.0、7.0和13.0 g/L时，菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的拮抗圈直径分别为2.19、2.36和2.81 cm，显著高于其他浓度下的拮抗活性。因此，在后续的3因素3水平正交试验中，糯米粉采用5.0、7.0和9.0 g/L3个水平，酵母浸粉采用5.0、7.0和9.0 g/L3个水平，硫酸锌采用11.0、13.0和15.0 g/L 3个水平较合理。

2.3.3碳源、氮源及无机盐正交试验结果根据正交试验结果（表2），比较3种因素的R值可知Rgt;Rggt;Rc，表明糯米粉的浓度变化对菌株HC-5拮抗活性的影响最大，其次为酵母浸粉，再次为硫酸锌，最优组合为A₁B₂C₁，得到最优培养基组分组合为糯米粉5.0 g/L、酵母浸粉7.0 g/L和硫酸锌11.0 g/L。

2.4菌株HC-5发酵条件优化结果

2.4.1培养温度、培养时间和接种量单因素试验结果在不同的培养温度、培养时间和接种量下，菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的拮抗活性存在显著差异（图8），随着培养温度、培养时间和接种量的增加，菌株HC-5的拮抗活性均呈逐渐上升后下降的变化趋势。在培养温度为30～40℃、培养时间为24～48 h及接种量为0.5%～2.0%时，菌株HC-5的拮抗活性较

好，其中，当培养温度为35℃、培养时间为36 h及接种量为1.0%时，菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的抑菌圈直径均达最大值，分别为2.81、3.15和2.32 cm，因此，培养温度、培养时间和接种量正交试验的3个水平分别选择30、35、40℃和24、36、48 h及0.5%、1.0%、2.0%较合理。

2.4.2培养温度、培养时间和接种量正交试验根据正交试验结果（表3），比较3种因素的R值可知RAgt;Rgt;Rc，表明培养温度对菌株HC-5的拮抗活性影响最大，其次为发酵时间，再次为接种量，最优组合为A₂B₂C₂，因此，最优培养温度、发酵时间和接种量分别为35℃、36h和1.0%。

2.4.3转速、装液量和初始pH单因素试验结果

在不同的转速、装液量和初始pH下，菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的拮抗活性存在显著差异（图9），随着初始装液量和初始pH的增加，菌株HC-5的拮抗活性呈逐渐上升后下降的趋势，而随转速的增加其拮抗活性呈先下降后上升再下降的变化趋势。在转速为120～210 r/min、装液量为60～140 mL及初始pH为5.0～7.0时，菌株HC-5的拮抗活性较好，其中，当转速为180 r/min、装液量为80 mL及初始pH为5.5时，菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的抑菌圈直径最大，分别为2.22、2.92和2.98 cm，因此，转速、装液量和初始pH正交试验的3个水平分别选择150、180、210 r/min和60、80、100 mL及5.0、5.5、6.0较合理。

2.4.4转速、装液量及初始pH根据正交试验结果（表4），比较3种因素的R值可知RAgt;R₂gt;Rc，表明转速变化对菌株HC-5的拮抗活性影响最大，其次为初始pH，再次为装液量，最优组合为A₂B₂C₃，即当摇床转速为180 r/min、pH为5.5和装液量为100 mL时拮抗活性最好。

2.5平板抑菌活性验证结果

将菌株HC-5按照常规条件接种至LB和发酵培养基中，并进行摇床培养，菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的抑菌圈直径分别为1.72和1.86 cm。相比之下，在优化后的条件下菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的抑菌效果明显提高，抑菌圈直径增大至3.03 cm（图10），与LB和发酵培养基中常规发酵条件相比，抑菌圈直径分别增大76.2%和62.9%，说明优化后的培养基更有利于菌株HC-5活性物质的产生。

3讨论

随着生姜种植面积的日益扩大，青枯病对其造成的威胁也日益加剧。目前，国内对生姜青枯病的防治主要依靠传统的农业和化学方法，但这些方法的效果并不尽如人意（Jiang et al.，2017）。此外，考虑到生姜作为药食两用作物的特性，以及环境保护和食品安全的重要性，化学农药的使用正面临越来越严格的限制。芽孢杆菌是一类在自然界中广泛分布、具有强抗逆性的细菌，被证实能有效抵抗高温、高压等恶劣环境（张红艳等，2018;尉婧等，2022;李青等，2023）。贝莱斯芽孢杆菌是当前被研究和开发最广的生防芽孢杆菌之一，有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌对多种作物上的青枯病菌具有良好的抑制作用。冯印印等（2021）采用牛津杯法分离到1株对烟草青枯病菌具有较好拮抗效果的贝莱斯芽孢菌FY-C，其无菌滤液对青枯病菌产生的抑菌活性表现出较强的热稳定性、酸碱稳定性。王世伟和王卿惠（2022）报道贝莱斯芽孢杆菌菌株HNU24及其发酵液不但能有效抑制番茄青枯病菌的生长，还能有效促进番茄植株生长。本研究从生姜根际土壤中分离出307株芽孢杆菌，通过抑菌圈法筛选出1株对生姜青枯病菌具有较强抑制作用的菌株HC-5，其抑菌圈直径达0.71 cm。通过形态学和分子生物学等方法综合鉴定，确定其为贝菜斯芽孢杆菌。

研究表明，贝莱斯芽孢杆菌在其生长和繁殖过程中能产生多种具有抑菌活性的代谢产物，包括杆菌溶素、地非西丁、伊枯草菌素和表面活性素等（Chowdhury et al.，2015）。通过发酵培养基和发酵条件优化，可显著提高这些代谢产物的产量。纪帅奇等（2023）对贝莱斯芽孢杆菌SN-20的发酵条件进行优化后发现，菌株SN-20的最佳发酵条件为接种量3%、装液量20%、发酵时间36 h、发酵温度32℃;优化后的发酵条件使菌株SN-20产生的抗菌脂肽产量提高了21.85%。本研究以菌株HC-5无菌上清液对青枯病菌的抑菌活性为指标，通过单因素和正交试验对其发酵培养基和发酵条件进行优化，发现在最佳发酵条件下菌株HC-5无菌上清液对青枯菌的抑菌圈直径为3.03 cm，相比于LB和发酵培养基条件下分别增大76.2%和62.9%，表明通过发酵培养基和发酵条件优化可有效提升菌株HC-5的拮抗活性。然而，不同菌株对发酵培养基组分和发酵条件的偏好可能不同，相同发酵条件下不同菌株的抑菌活性和代谢物质产量可能存在差异（王玲等，2014）。因此，进一步的研究应当适当考虑不同菌株的特性，并在发酵罐等更加接近实际生产条件的环境中进行验证。此外，在后续的研究中，还应对菌株HC-5在生姜植株内的定殖能力、生防机制，以及生防制剂的研发等作进一步探索，从而为菌株HC-5的实际田间应用和生防策略的优化提供理论依据。

4结论

从生姜根际土壤中分离获得1株对生姜青枯病菌具有良好拮抗效果的贝莱斯芽孢杆菌HC-5，该菌的最适发酵培养基组分为糯米粉5.0 g/L、酵母浸粉7.0 g/L、硫酸锌11.0 g/L，最适发酵条件为培养温度35℃、培养时间36h、接种量1.0%、转速180r/min、初始pH 5.5、装液量100mL。优化后的方案显著提高了菌株HC-5无菌上清液对生姜青枯病菌的抑菌效果。菌株HC-5具有开发成生姜青枯病生防菌剂的潜力。

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（责任编辑 麻小燕）