产表面活性剂解烃菌的筛选及其发酵条件优化

摘要：为了获得产表面活性剂解烃菌，经血平板筛选和发酵液排油活性测定，从新疆石油污染土壤中分离出1株能产生物表面活性剂的石油降解菌B-1。通过形态和生理生化特征分析，初步鉴定该菌为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。通过产量指标对菌株B-1 产生物表面活性剂的条件进行优化，确定其最适发酵条件为：pH值7.5、温度30 ℃、盐浓度5 g/L，在此条件下，生物表面活性剂产量可达1.76 g/L。薄层色谱分析结果表明，B-1产脂肽、脂蛋白类生物表面活性剂，可将发酵液表面张力从68.20 mN/m降低到31.70 mN/m，乳化指数（E24）达到92.80%。

关键词：石油降解菌；生物表面活性剂；表面张力；发酵条件

中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0437-03

收稿日期：2014-11-17

基金项目：新疆石河子大学优秀青年项目（编号：2012ZRKXYQ10）。

作者简介：杨乐（1980—），女，河南南阳人，硕士，讲师，从事环境污染修复研究工作。E-mail：yl_shzu@163.com。生物表面活性剂是微生物在一定条件下分泌的胞外或者膜结合型的具有表面活性的两性化合物，具有降低表面张力、稳定乳化液等特性。由于微生物的差异性，其代谢产生的表面活性剂具有多样的化学结构，包括脂肽、糖脂、磷脂、脂肪酸、中性脂质和聚合类生物表面活性剂[1-2]。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂低毒，可生物降解，能适应极端环境，具有更好的选择性和专一性、环境友好性等优点，因而越来越受到人们的青睐，在社会生产和生活各领域具有广泛的应用前景[3-4]。

碳氢化合物是导致环境退化的主要污染物，具有一定的毒性和疏水性，在土壤环境中难以自然降解，给生态安全和生物健康带来了巨大风险。大量研究表明，生物表面活性剂通过乳化作用和降低油水界面张力，对疏水性石油烃具有增溶作用，提高了石油烃的可生物利用性，进而加快油污土壤的修复过程[5-8]。因此，筛选具有产表面活性剂和降解石油烃功能的微生物，在修复石油污染土壤方面具有重要的应用潜力。

本研究的目的是从新疆地区石油污染土壤中筛选具有高效产表面活性剂能力的石油烃降解菌，优化该菌株产生物表面活性剂的发酵条件，同时考察其产生的生物表面活性剂类型和性能，以期为探索产表面活性剂的解烃菌在新疆石油污染土壤中的应用提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验菌株分离土壤采自新疆独山子石油污染土壤；原油取自独山子炼油厂。

试验所用培养基：（1）无机盐培养基：1.0 g/L K2HPO4·3H2O，1.0 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，1.0 g/L NH4NO3，0.02 g/L CaCl2，痕量FeCl3，pH值7.5；（2）血平板，购自上海抚生生物科技有限公司；（3）发酵培养基：20 g/L葡萄糖，5 g/L蛋白胨，3 g/L酵母提取物，5 g/L NaCl，pH值75；（4）降解培养基：为无机盐培养基，含1 g/L原油，pH值7.5。

1.2产生物表面活性剂解烃菌的筛选

称取10 g土样加入到含1 000 mg/L石油的100 mL无机盐培养基中，于30 ℃、150 r/min进行富集培养，每隔5 d取培养液并以10%的转接量依次转入新鲜无机盐培养基中，并逐步提高石油浓度到1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L。通过观察石油消失与否判断石油的降解程度，连续驯化传代5次后，取0.1 mL培养液涂布于血平板上培养24 h，选择周围有溶血圈的菌落，挑取单菌落，连续划线纯培养3次，得到1株纯化菌株，命名为B-1，挑取菌株到LB斜面进行保存备用。将斜面保存的菌株B-1接入发酵培养基中，恒温（30 ℃、150 r/min）培养48 h，测定发酵液排油圈大小，以确定其是否能够产生生物表面活性剂。

1.3菌株鉴定

将所筛选菌株接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，在30 ℃下培养24 h，观察菌落外部形态特征，参照《常见细菌鉴定手册》[9]对菌株B-1进行生理生化特性鉴定。

1.4种子培养和发酵培养

种子培养：从LB斜面中挑取1环菌接种于装有100 mL发酵液的锥形瓶中，于30 ℃、150 r/min培养24 h。

发酵培养：取培养24 h的种子液，以1%的接种量接种至装有100 mL发酵液的锥形瓶中，于30 ℃、150 r/min培养 48 h。

1.5生物表面活性剂的提取

将菌株B-1培养48 h的发酵液离心（4 ℃、6 000 r/min，10 min）去除菌体，上清液用6 mol/L HCl调节pH值为2.0，4 ℃静置过夜收集沉淀物（4 ℃、8 000 r/min，15 min），再用二氯甲烷萃取沉淀物并离心收集（4 ℃、10 000 r/min，10 min），抽真空干燥至恒质量，确定表面活性剂产量。

1.6发酵条件的优化

1.6.1pH值对生物表面活性剂产量的影响 将菌株B-1的种子液按体积分数1%接入到发酵培养基中，利用HCl、NaOH溶液分别将pH值调节为6.0、7.0、7.5、8.0、9.0，在 30 ℃、150 r/min培养48 h，按照上述提取生物表面活性剂的方法，研究初始pH值对生物表面活性剂产量的影响。

1.6.2温度对生物表面活性剂产量的影响确定发酵培养基的最适pH值后，将菌株B-1接种于新鲜发酵培养基中，分别放置于20、25、30、35、40 ℃条件下，在初始pH值为7.5的条件下培养48 h，按照生物表面活性剂的提取方法对生物表面活性剂进行提取和测定，研究发酵培养基的最适温度。

1.6.3盐浓度对生物表面活性剂产量的影响用NaCl调节发酵培养基中的盐浓度分别为0、5、10、30、50、70 g/L，在pH值为7.5、温度30 ℃条件下培养48 h，提取发酵液中的生物表面活性剂，研究发酵培养基的最适盐浓度。

1.7生物表面活性剂性能的测定

生物表面活性剂的定性分析：取0.1 g生物表面活性剂溶解于50 mL甲醇中，在硅胶板上采用薄层色谱法进行分析[10]。

生物表面活性剂稳定性评价：以未接菌的培养液作对照，将菌株B-1活化后接种于发酵培养基中，在30 ℃、150 r/min条件下培养48 h，参照文献[11-12]的方法，取一定量的发酵上清液进行排油试验，以及表面张力、乳化指数（E24）的测定，相应公式如下：

E24=乳化层高度/混合液总高度×100%。2结果与分析

2.1产生物表面活性剂解烃菌的筛选与鉴定

2.1.1菌株的筛选经富集分离和纯化，从独山子石油污染土壤中筛选出能够降解石油并在血平板培养过程中出现溶血圈的菌株1株，命名为B-1。通过发酵培养和排油活性测定，石油降解菌B-1能够形成6.0 cm的排油圈，而对照液滴则由石蜡穿过，没有排油圈形成。一般而言，排油圈的直径与表面活性剂含量成正比，试验结果表明，菌株B-1能够产生表面活性物质。

2.1.2菌株的鉴定菌株B-1菌落呈乳白色，不透明，较干燥，有褶皱，在血琼脂培养基上形成溶血圈；菌体为革兰氏阳性杆菌，有芽孢，无荚膜，有鞭毛，能运动。B-1主要生理生化特征见表1，分析可知，菌株B-1为芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp.）。

表1菌株B-1主要的生理生化特性

指标类型特性氧化酶-H2O2酶+淀粉水解+M.R试验-V.P.试验+吲哚试验-葡萄糖利用产酸不产气硝酸盐还原+明胶液化+注：“+”“-”分别表示试验结果为阳性、阴性。

2.2发酵条件优化

生物表面活性剂是微生物的次生代谢产物，不同微生物合成代谢物的最适环境条件差异较大。环境条件会影响微生物的生长及次生代谢产物的产生，因此需要从pH值、温度、盐浓度方面对B-1的发酵条件进行考察优化。

2.2.1初始pH值对菌株B-1产表面活性剂的影响从图1可见，初始pH值对菌株B-1产表面活性剂的影响较小，在pH值6.0～9.0的范围内都可以产生表面活性物质；随着培养基初始pH值的增加，菌株分泌表面活性剂的量增加，当培养基初始pH值为7.5时表面活性剂产量达到最大值，为176 g/L；随后随着pH值增加，产量下降，与已报道的表面活性剂产生菌的最适pH值6.0～7.0相比，芽孢杆菌B-1更适应于偏碱性的环境。

2.2.2温度对菌株B-1产表面活性剂的影响从图2可以看出，随着培养温度的升高，表面活性剂产量增加，在30 ℃时，菌株B-1的表面活性剂产量达到最大值；随后表面活性剂产量开始下降，在40 ℃时，B-1表面活性剂产量最低。

2.2.3盐浓度对菌株B-1产表面活性剂的影响由图3可见，盐浓度在0～10 g/L对降解菌B-1产表面活性剂的影响较小，当培养基含盐量为5 g/L时，表面活性剂产量达到最大值；盐浓度超过30 g/L时，开始抑制表面活性剂的产生；菌株B-1有较高的耐盐能力，在盐浓度为 70 g/L时仍然分泌表面活性物质。研究结果表明，菌株B-1受低渗透压的影响不大，有一定耐受高渗透压的能力，具备在一定盐碱环境中降解石油污染物的基础。综合以上研究，石油降解菌B-1产表面活性剂的最适条件为pH 值7.5、温度 30 ℃、盐浓度5 g/L，在此条件下，生物表面活性剂产量可达1.76 g/L。

2.3生物表面活性剂的定性分析

生物表面活性剂包括糖脂、脂肽、磷脂质、中性脂、脂肪酸和高分子脂类物质，生物表面活性剂的类型既与菌株有关，又与底物有关。先将菌株B-1培养48 h，再将发酵液离心，取上清液酸化（pH值为2），放置于冰箱中过夜，有白色沉淀产生；经薄层色谱法定性分析，与莫氏试剂接触后不显色，表明样品中没有糖类成分，而与茚三酮接触后显色，表明样品中有氨基存在，初步判定生物表面活性剂为脂肽、脂蛋白类物质。

2.4生物表面活性剂性能评价

表面活性剂性能评价方法包括测定排油活性、表面张力、油水乳化稳定性、临界胶束浓度及HLB值（亲水亲油平衡值）等，以未接菌的发酵液为对照，在最优发酵条件下，分别测定菌株B-1发酵上清液的排油活性、表面张力和油水乳化稳定性。

研究结果表明，菌株B-1在石蜡液面能够形成直径为7.5 cm的排油圈，而对照没有排油圈形成；此外，解烃菌B-1能显著降低发酵液的表面张力，由最初的68.20 mN/m降到31.70 mN/m，表明该菌株具有较高的表面活性。将B-1发酵液与液体石蜡混合，静置24 h后测定的乳化指数为9280%，大于50%，表明该菌株具有较强的乳化活性和稳定性。

3结论

从新疆石油污染土壤中筛选出1株产生物表面活性剂石油降解菌，命名为B-1，形态和生理生化初步鉴定表明，B-1为芽孢杆菌属细菌（Bacillus sp.）。菌株B-1所产的生物表面活性剂初步判定为脂肽、脂蛋白类物质，采用单因素试验对菌株的发酵条件进行优化，得到其最适pH值为7.5，培养温度为30 ℃，盐浓度为5 g/L，在此条件下，生物表面活性剂产量可达1.76 g/L。在最优发酵条件下，菌株B-1能将发酵液的表面张力由68.20 mN/m降至31.70 mN/m，表明该菌株具有较强的降低表面张力的能力；油水乳化指数为92.80%，表明该菌株具有较强的乳化活性和稳定性，在石油污染土壤生物修复过程中具有较高的实用价值和应用前景。

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