水禽细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立与应用

汪宏才 商雨 马瑶 曾哲 张蓉蓉 姚伦 罗玲 李丽 温国元 罗青平

摘要：为了建立水禽细小病毒（WPV）快速检测方法，根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物，建立SYBR Green I荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率（E）为90.0%，相关系数（R2）=0.99，标准曲线方程为y=-3.607x+38.77；除WPV出现S形扩增曲线外，新城疫病毒（NDV）、H9亚型禽流感病毒（H9 AIV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）、鸭肝炎病毒（DHAV）、鸭肠炎病毒（DEV）、鸭呼肠孤病毒（DRV）样品均未出现S形阳性扩增曲线；批内变异系数（CV）为0.15%～0.23%，批间变异系数为0.09%～0.28%。结果表明，SYBR Green I荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明，SYBR Green I荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%，灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green I荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV，还可以进行定量检测，可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测，也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

关键词：水禽细小病毒；检测方法；SYBR Green I；荧光定量PCR

中图分类号：S855.3         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）06-0218-08

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.036 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishment and application of a SYBR Green I fluorescence quantitative PCR detection method for waterfowl parvoviruses

WANG Hong-cai1，2，SHANG Yu1，2，MA Yao1a，ZENG Zhe1，2，ZHANG Rong-rong1，2，YAO Lun1，2，

LUO Ling1，2，Li Li1a，WEN Guo-yuan1，2，LUO Qing-ping1，2

（1a.Institute of Animal Husbandry and Veterinary； 1b. Key Laboratory of Animal Bacterial Disease Prevention and Control Formulations of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs； 1c.Hubei Key Laboratory of Pathogenic Microbiology of Livestock and Poultry， Hubei Academy of Agricultural Sciences ，Wuhan 430064， China； 2. Hubei Hongshan Laboratory，Wuhan 430070， China）

Abstract： In order to establish a rapid detection method for waterfowl parvoviruses （WPV）， specific primers were designed within the conserved SF3 region of the NS gene of waterfowl parvoviruses based on sequence alignment results， and a SYBR Green I fluorescence quantitative PCR universal detection method was established. The amplification efficiency （E） of this method was 90.0%， the correlation coefficient （R2） was 0.99， and the standard curve equation was y=-3.607x+38.77；except for WPV with an S-shaped amplification curve， the newcastle disease virus （NDV）， H9 subtype avian influenza virus （H9 AIV）， duck tembusu virus （DTMUV）， duck hepatitis A virus （DHAV）， duck enteritis virus （DEV）， and duck reovirus （DRV） samples did not show an S-shaped positive amplification curve；the coefficient of variation （CV） within a batch was 0.15% to 0.23%， and the coefficient of variation between batches was 0.09% to 0.28%. The results indicated that the SYBR Green I fluorescence quantitative PCR detection method had good repeatability， high sensitivity， and strong specificity. The clinical sample testing results showed that the coincidence rate between SYBR Green I fluorescence quantitative PCR and conventional PCR was 98.4%， and the sensitivity was 1 000 times higher than that of conventional PCR. The SYBR Green I fluorescence quantitative PCR detection method could not only qualitatively detect WPV， but also quantitatively detect it. It could be used for WPV purification detection in duck and goose breeding farms， as well as for rapid detection of WPV in large clinical samples.

Key words： waterfowl parvoviruses； detection method； SYBR Green I； fluorescence quantitative PCR

水禽细小病毒（Waterfowl parvoviruses，WPV）属于雁形目依赖细小病毒1型（Anseriform dependoparvovirus 1）［1］，包括鹅细小病毒（Goose parvovirus， GPV）、番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）和鸭细小病毒（Duck parvovirus，DPV），三者在病毒形态、培养特性、理化性质及基因组结构等方面具有相似性，但致病性和抗原性却存在很大差异［2］。GPV主要引起雏鹅和番鸭发病，MDPV仅引起番鸭发病，而对鹅、鸭等不致病，DPV是GPV变异株，主要引起鸭发生短喙侏儒综合征（Short beak and dwarfism， SBDS）。WPV具有二十面体结构，无包膜，基因组为线性单链DNA，大小为4～6 kb［3］。基因组包含2个主要的开放阅读框，编码非结构蛋白（Non-structural protein， NS）和结构蛋白（Viral structural protein， VP）。最大的NS蛋白是一种多结构域蛋白，含有高度保守的解旋酶超家族3（Superfamily 3， SF3）结构域，具有解旋酶和ATP酶活性［4］。

为了准确快速诊断水禽细小病毒，国内外学者建立了多种检测方法。早期建立的抗原抗体检测方法主要有乳胶凝集法（Latex particle agglutination test， LPA）［5］、间接免疫荧光法（Immunofluorescence assay， IFA）［6］、ELISA法［7，8］等。而分子生物学检测方法由于快捷方便、敏感性高、特异性强等特点，常用于病原的快速检测，主要包含常规PCR方法、不同血清型鉴别诊断PCR方法［9，10］、基于VP3基因的荧光定量PCR检测方法［11-13］等。

由于水禽细小病毒的基因具有变异快、易重组等特点，因此在诊断时很容易漏检或造成假阴性。在缺少通用、快速检测水禽细小病毒方法的情况下，建立一种通用型细小病毒SYBR Green I 荧光定量快速检测方法，为水禽细小病毒进一步鉴定和分型提供初步诊断。该方法不仅特异性高、敏感性强，而且操作简便、成本低廉。因此对临床上水禽细小病毒的快速诊断具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 新城疫病毒（Newcastle disease virus， NDV）、H9亚型禽流感病毒（H9 subtype avian influenza virus， H9 AIV）、鸭坦布苏病毒（Duck tembusu virus， DTMUV）、鸭肝炎病毒（Duck hepatitis A virus， DHAV）、鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus， DEV）、鸭呼肠孤病毒（Duck reovirus， DRV）和水禽细小病毒（WPV）均由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所分离保存。AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司；Plasmid Mini Kit I试剂盒、Gel Extraction Kit试剂盒购自OMEGA BIO-TEK公司；pMD18-T载体、E.coli DH5α感受态细胞购自宝日医生物技术（北京）有限公司；2×Rapid Taq Master Mix、AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要仪器 SimpliAmp PCR仪为Thermo Fisher公司产品，Light Cycler 96实时荧光定量PCR系统为Roche公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank上公开的WPV基因组序列，通过序列多重比对，在保守区设计引物，用于荧光定量PCR试验。

1.2.2 阳性标准品制备 按照试剂盒说明书提取DNA，并以GPV DNA为模板，使用“1.2.1”中设计的引物，通过2×Rapid Taq Master Mix进行PCR反应扩增目的片段。反应体系（50.0 μL）：Rapid Taq Master Mix 25.0 μL，Forward Primer 2.0 μL，Reverse Primer 2.0 μL，DNA 4.0 μL，ddH2O 17.0 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切取目的片段，回收纯化后克隆至pMD18-T载体上，转化至DH5α感受态细胞中，送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定。测序正确后提取阳性质粒pMD18-NS作为阳性标准品，检测其浓度并计算阳性标准品的拷贝数。

1.2.3 荧光定量反应条件与标准曲线的建立 将重组质粒pMD18-NS按10倍梯度进行稀释。SYBR Green I荧光定量PCR反应体系（20.0 μL）：2×AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O补充至20.0 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，40个循环。熔解曲线反应：65 ℃到95 ℃，每个循环温度增加0.5 ℃，孵育时间保持20 s。

1.2.4 重复性试验 将阳性标准品进行10倍梯度稀释，取10-3、10-5、10-7 3个稀释度的标准品作为生物学重复，用建立的SYBR Green I荧光定量检测方法进行检测。同时每个样品设置3个技术重复。根据Ct计算批内（技术重复）和批间（生物学重复）的变异系数，检验建立方法的重复性。

1.2.5 特异性试验 提取NDV、H9 AIV、DTMUV、DHAV、DEV、DRV和WPV的DNA/RNA后，将RNA反转录成cDNA，利用本试验建立的荧光定量检测方法，对上述病毒cDNA进行检测，验证建立方法的特异性。

1.2.6 灵敏度检测 将阳性标准品进行10倍梯度稀释，按“1.2.3”中反应体系和反应条件进行SYBR Green I荧光定量PCR反应，并设立阴性对照。仪器的最低检测量即为该方法的灵敏度。

1.2.7 通用性检测 提取GPV、MDPV和DPV 3种病毒的DNA，使用建立的检测方法进行通用性验证。

1.2.8 临床样品的检测 为了验证建立的荧光定量检测方法与常规PCR检测方法的符合率，使用新建的荧光定量PCR方法对实验室保存的湖北省、安徽省、湖南省等地区送检的128份疑似水禽细小病毒感染发病的临床样品进行检测，同时使用普通PCR进行对比验证，计算2种检测方法的符合率。

2 结果与分析

2.1 引物设计

根据GenBank上公开的GPV、DPV、MDPV基因组序列，下载386条完整的WPV核苷酸序列，使用Muscle［14］软件进行多重比对，选择非结构蛋白NS解旋酶（SF3）基因附近保守区域（图1），使用Primer Premier 5软件，设计了一组荧光定量PCR特异性扩增引物，Forward Primer：5′-TACAATGGAACACAGAATWCC-3′，Reverse Primer：5′-TCAGACACAACAGGAACWA-3′，扩增片段大小为150 bp。

2.2 阳性标准品制备

采用“2.1”中设计的引物进行扩增，目的条带大小为150 bp，与预期大小相同（图2）。将目的片段回收纯化，连接到pMD18-T载体上，得到重组质粒pMD18-NS，转化至DH5α感受态细胞后，经测序鉴定正确后，提取质粒作为阳性标准品，经测定质粒浓度为298.9 ng/μL，拷贝数为9.59×1010 copies/μL。

2.3 荧光定量反应条件与标准曲线的建立

将构建成功的重组质粒pMD18-NS，按10倍梯度进行稀释。选取10-7～10-3共5个稀释度的标准品，每个稀释度设3个样品重复，按照“1.2.3”的反应体系和反应条件进行扩增，扩增正常（图3），标准曲线如图4所示。结果显示，本方法扩增效率（E）为90.0%，R2=0.99，标准曲线的方程为y=-3.607x+38.77。熔解曲线（图5）显示，在79.00 ℃有单一峰，表明扩增产物特异性好。

2.4 重复性试验

由表1可知，批内变异系数（CV）在0.15%～0.23%。通过3个生物学重复试验测定批间变异系数，为0.09%～0.28%。建立的荧光定量PCR检测方法，批内和批间变异系数均低于0.30%，表明SYBR Green I荧光定量PCR检测方法重复性好、稳定性高。

2.5 特异性试验

用建立的SYBR Green I荧光定量检测方法对实验室保存的NDV、H9 AIV、DTMUV、DHAV、DEV、DRV和WPV进行检测，除WPV出现S形扩增曲线、结果呈阳性外，其他样品均未出现S形阳性扩增曲线，结果呈阴性（图6）。

2.6 灵敏度检测

由图7可知，当样品稀释度为10-6时可以看到PCR条带，当样品稀释度为10-7时无肉眼可见的条带出现。而建立的荧光定量PCR方法，当样品稀释至10-9时，对应的质粒拷贝数为95.9 copies/μL，仍出现S形扩增曲线，而阴性对照无扩增曲线。结果表明SYBR Green I荧光定量PCR检测方法灵敏度较高，灵敏度是普通PCR的1 000倍。

2.7 通用性验证

提取实验室分离鉴定的3种水禽细小病毒GPV、MDPV和DPV的DNA后，采用“1.2.3”中反应体系和反应程序，验证该方法对WPV的通用性，结果如图8所示。GPV、MDPV和DPV都出现S形扩增曲线，阴性对照无扩增。

2.8 临床样品的检测

采用SYBR Green I荧光定量PCR检测方法对湖北省、安徽省、湖南省等地区送检的蛋鸭、番鸭、鹅128份临床样品进行检测，同时使用普通PCR进行验证，计算2种检测方法的符合率。由表2可知，SYBR Green I荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%。

3 讨论

近年来，水禽生产上细小病毒的发病率一直居高不下，病毒在环境中受到自然选择压力的作用，产生基因突变或重组，并能突破种间屏障实现跳跃式进化，造成新的基因型不断出现。基因重组是病毒遗传变异和进化的主要手段，尤其是细小病毒VP基因，极易发生重组。GPV DY16株可能由匈牙利的B株和国内弱毒疫苗SYG61v株参与的重组毒株，重组区域主要发生在VP1基因内部［15］，MDPV JH10株为经典型MDPV和GPV之间的重组产物，主要在VP3基因中通过重组获得不同来源的GPV序列［16］。MDPV NY18株是多个病毒之间重组的产物，以典型MDPV YY株为主要亲本，经典型GPV强毒株DY16株和鹅胚化的弱毒疫苗株SYG61v株作为次要亲本参与了重组，重组区域主要发生在VP1和VP3区域［17］。

早期研究发现VP3蛋白是细小病毒的主要抗原蛋白，含量约占整个病毒粒子的80%［18］，因此常将VP3基因的同源性作为细小病毒分类的主要依据。很多学者在VP3区域设计引物，建立了LAMP快速检测方法［19，20］、多联PCR检测方法［21］等。早期也有学者［22］针对WPV在鹅和番鸭中传播，在ITR区域设计引物和探针，建立了探针法荧光定量PCR检测方法。VP3基因编码结构蛋白，易突变和重组；ITR区域为高GC区域，易形成发夹结构。NS基因相对保守，更具有种属特征，尤其是SF3基因序列更具有保守性，因此，在NS基因上设计检测引物，检测水禽细小病毒。

本研究根据NS基因保守序列设计引物，建立SYBR Green I荧光定量PCR检测方法，其特异性强、灵敏度高，与普通PCR的符合率达98.4%，灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green I荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV，还可以进行定量检测，可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测，也可用于WPV临床快速诊断。同时，由于SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有精准、快速的特点，因此更适用于临床大量样品的快速检测。

参考文献：

［1］ WO?NIAKOWSKI G， KOZDRU? W， SAMOREK-SALAMONOWICZ E. Genetic variance of Derzsys disease strains isolated in Poland［J］. Journal of molecular & genetic medicine， 2009，3（2）： 210-216.

［2］ CHEN Y， AFUMBA R， PANG F， et al. Advances in research on genetic relationships of waterfowl parvoviruses［J］. Journal of veterinary research， 2021，65（4）： 391-399.

［3］ COTMORE S F， AGBANDJE-MCKENNA M， CANUTI M， et al. ICTV virus taxonomy profile： Parvoviridae［J］. Journal of general virology， 2019，100（3）： 367-368.

［4］ P?NZES J J， S?DERLUND-VENERMO M， CANUTI M， et al. Reorganizing the family Parvoviridae：A revised taxonomy independent of the canonical approach based on host association［J］. Archives of virology， 2020，165（9）： 2133-2146.

［5］ 朱小丽， 陈少莺， 林锋强， 等. 应用胶乳凝集技术诊断番鸭小鹅瘟病［J］. 中国预防兽医学报， 2012，34（9）： 715-718.

［6］ 俞 博， 朱小丽， 程晓霞， 等. 应用间接免疫荧光法诊断鸭短嘴矮小综合征［J］. 福建农业学报， 2017，32（12）： 1332-1334.

［7］ 宫晓华. 新型鸭细小病毒DS-15株生物学特性研究及间接ELISA方法的建立［D］. 合肥：安徽农业大学， 2017.

［8］ 刘 铭. 鸭细小病毒抗体ELISA检测方法的建立及卵黄抗体的制备［D］. 河北保定：河北农业大学， 2020.

［9］ 刘家森， 姜 骞， 司昌德， 等. 番鸭细小病毒与鹅细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立［J］. 中国兽医科学， 2007（6）： 469-472.

［10］ WAN C， CHENG L， CHEN C， et al. A duplex PCR assay for the simultaneous detection and differentiation of Muscovy duck parvovirus and goose parvovirus［J］. Molecular and cellular probes， 2019，47： 101439.

［11］ 周洁文， 汤傲星， 戚睿斌， 等. 新型鸭细小病毒SYBR Green I 荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用［J］. 中国动物传染病学报， 2020，28（4）： 47-51.

［12］ NIU X， CHEN H， YANG J， et al. Development of a TaqMan-based real-time PCR assay for the detection of Novel GPV［J］. Journal of virological methods， 2016，237： 32-37.

［13］ 曹旭阳， 王宇飞， 张志飞， 等. 鸭源新型鹅细小病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立及初步应用［J］. 中国动物传染病学报， 2020，28（5）： 31-36.

［14］ EDGAR R C. MUSCLE：Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput［J］. Nucleic acids research， 2004，    32（5）： 1792-1797.

［15］ 贾婧宇， 凌珏怡， 王志仙， 等. 鹅细小病毒DY16株的分子鉴定及重组分析［J］. 中国兽医学报， 2019，39（5）： 848-852.

［16］ 王志仙， 秘清灵， 凌珏怡， 等. 重组型番鸭细小病毒JH10株的分子特征解析［J］. 中国动物传染病学报， 2020，28（2）： 66-71.

［17］ 鲍 芳， 秘清灵， 徐静雯， 等. 1株重组型番鸭细小病毒的分子特征解析［J］. 中国兽医学报， 2021，41（1）： 33-37.

［18］ TU M， LIU F， CHEN S， et al. Role of capsid proteins in parvoviruses infection［J］. Virology journal， 2015，12： 114.

［19］ 尚 毅， 董嘉文， 孙敏华， 等. 鹅细小病毒LAMP快速检测方法的建立［J］. 华南农业大学学报， 2011，32（1）： 98-102.

［20］ 王 耕， 田克恭， 张 薇， 等. 鸭细小病毒实时荧光LAMP检测方法的建立与应用［J］. 畜禽业， 2022，33（3）： 6-8.

［21］ 季艳菊， 王林川. 番鸭三种细小病毒多联PCR检测方法的建立与初步应用［J］. 中国动物检疫， 2016，33（4）： 85-90.

［22］ WO?NIAKOWSKI G， SAMOREK-SALAMONOWICZ E， KOZDRU? W. Quantitative analysis of waterfowl parvoviruses in geese and Muscovy ducks by  real-time polymerase chain reaction： correlation between age， clinical symptoms and DNA copy number of waterfowl parvoviruses［J］. BMC veterinary research， 2012，8： 29.