基于非靶向代谢组学挖掘两种日粮模式下蛋鸡回肠代谢物的差异

张应胡 秦绪光 马丽 王皓杰 胡玲 田光明

摘要：为探究饲喂基础日粮（CON）和含5.0%益生菌发酵饲料（PFF）2种日粮条件下蛋鸡回肠内容物代谢物差异，采用液相色谱-质谱和非靶向代谢组学相结合的方法，检测2种日粮条件下蛋鸡回肠中代谢产物，通过差异代谢物筛选和KEGG富集分析，筛选出蛋鸡回肠中的差异代谢物及代谢通路。结果表明，与CON组相比，PFF组中胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸等胆汁酸含量显著降低，异亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸、亮氨酸-酪氨酸-苏氨酸-赖氨酸等小肽含量显著增加；KEGG通路富集分析表明，代谢物主要与胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成等通路相关，初级胆汁酸在宿主脂质和脂溶性物质的消化代谢、抗氧化状态、胆固醇代谢和宿主-微生物相互作用中发挥重要作用。蛋鸡日粮中添加益生菌发酵饲料可通过改变肠道代谢产物来改善肠道吸收功能。

关键词：发酵饲料；蛋鸡；回肠代谢产物；非靶向代谢组学

中图分类号：S831.5         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2024）06-0213-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2024.06.035 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Exploring the differences in ileal metabolites of laying hens under two different dietary patterns based on non targeted metabolomics

ZHANG Ying-hu1， QIN Xu-guang2， MA Li1， WANG Hao-jie1， HU Ling1， TIAN Guang-ming1

（1.College of Animal Science and Technology， Yangtze University， Jingzhou  434025， Hubei， China； 2.Rizhao Animal Disease Prevention and Control Center， Rizhao  276826， Shandong， China）

Abstract： To investigate the differences in metabolites in the ileum contents of laying hens fed with two different dietary conditions： basal diet （CON） and fermented feed containing 5.0% probiotics （PFF），a combination of liquid chromatography-mass spectrometry and non targeted metabolomics was used to detect metabolites in the ileum of laying hens under two different dietary conditions. Differential metabolite screening and KEGG enrichment analysis were performed to screen for differential metabolites and metabolic pathways in the ileum of laying hens. The results showed that compared with the CON group， the content of bile acids such as bile acid， taurine goose deoxycholic acid， and goose deoxycholic acid in the PFF group was significantly reduced， while the content of small peptides such as isoleucine-leucine-glycine-alanine， phenylalanine-glutamate-valine-glutamate， and leucine-tyrosine-threonine-lysine was significantly increased；KEGG pathway enrichment analysis showed that metabolites were mainly related to pathways such as bile secretion and primary bile acid biosynthesis. Primary bile acids played important roles in the digestion and metabolism of host lipids and lipophilic substances， antioxidant status， cholesterol metabolism， and host-microbial interactions. Adding probiotic fermented feed to the diet of laying hens could improve intestinal absorption function by altering intestinal metabolites.

Key words：fermented feed； laying hens； ileal metabolites； non-targeted metabolomics

蛋鸡养殖是中国畜禽行业的重要组成部分。然而，在集约化养殖中蛋鸡运动受限，导致蛋鸡肠道代谢性能下降，降低了营养物质的消化吸收效率，进而降低了生产性能。育雏期是蛋鸡养殖的关键时期，该时期的蛋鸡与其他畜禽相比消化道较短，未完全发育的肠道免疫力较弱，肠道消化吸收与屏障功能易受影响。有研究表明，饲喂益生菌发酵饲料能够减少抗生素的使用，提高畜禽生产性能、机体免疫力及产品品质等［1，2］。目前，发酵饲料在蛋鸡中的研究集中在生产性能、血清指标、肠道组织形态及肠道微生物菌群等方面［3，4］，而益生菌发酵饲料如何影响蛋鸡肠道代谢产物的相关研究较少。

代谢组学可以对生物体液、细胞和组织中的代谢物进行分析，通常用作生物标志物发现的工具［5］。肠道代谢物能够调控机体新陈代谢和炎症反应等，通过对代谢物的定性、定量及差异分析，有助于寻找代谢物与生物过程之间的联系［6］。近年来，代谢组学技术已广泛应用于畜禽行业，Huang等［7］基于血清代谢组学发现饲喂发酵饲料仔猪血清中的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和乳酸水平显著升高。Chen等［8］利用非靶向和靶向代谢组学鉴定发现L-脯氨酸、L-缬氨酸和L-去甲亮氨酸可以作为鸡肠炎沙门氏菌污染的生物标志物。然而，使用代谢组学进行蛋鸡肠道代谢物研究鲜见报道。

本研究利用液相色谱-质谱（LC-MS）结合非靶向代谢组学技术，以饲喂基础日粮（CON）和含5.0%益生菌的发酵饲料（PFF）2组蛋鸡回肠内容物为试验材料，通过筛选找出差异代谢物，并对差异代谢物进行KEGG通路分析。旨在探究益生菌发酵饲料对蛋鸡肠道代谢产物的影响及相关代谢通路的变化。

1 材料与方法

1.1 试验设计与样品采集

选择体重相近的1日龄蛋鸡（京粉1号）180只，随机分为2组，每组6个重复，每个重复15只，鸡舍光照和温度根据养殖指导手册进行调整，蛋鸡自由饮水采食。对照组（CON）饲喂基础日粮（基础日粮成分如表1、表2所示），试验组（PFF）将5.0%基础日粮替换为益生菌发酵饲料，参考Guo等［9］的方法制备益生菌发酵饲料。试验第42天，在每个重复中随机选择1只鸡。将雏鸡颈椎脱臼法安乐死，收集2～3 g回肠内容物至冻存管中，液氮速冻，-80 ℃存储，以备下一步分析。

1.2 回肠内容物代谢组检测与分析

1.2.1 样本处理与检测 冰上解冻样品，取20 mg样品加入400 μL 70%甲醇水内标提取液，涡旋3 min，冰浴超声波10 min，涡旋1 min，于-20 ℃静置30 min后离心去除沉淀。取上清液在4 ℃ 12 000 r/min条件下离心3 min，取200 μL上清液进行LC-MS分析。

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温为40 ℃；采用二元流动相洗脱，流速为0.4 mL/min；进样量为2 μL；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脱方法如表3所示。

1.2.2 数据处理与分析 通过ProteoWizard软件将LC-MS获取的原始数据文件转换为mzML格式。用XCMS程序分别进行峰提取、峰对准和保留时间校正。采用支持向量回归（SVR）方法对峰面积进行校正。过滤每组样品中检出率低于50%的峰，并通过检索实验室自建数据库、综合公共数据库、AI数据库及metDNA方法得到代谢物鉴定信息。

以变量投影重要性（Variable importance in projection，VIP）和差异倍数（Fold change，FC）为条件进行差异代谢物的筛选（VIP≥1，|Log2FC|≥1.0）。使用KEGG Compound数据库对差异代谢物进行标注，然后映射到KEGG pathway数据库。

2 结果与分析

2.1 肠道代谢产物总览

本试验选取2组共12个样品进行代谢研究，共检测到8 125个代谢物，正、负离子模式下分别有    4 697、3 428个代谢物。对所有的代谢化合物进行分类分析发现，正离子模式下主要为氨基酸及其代谢产物（24.78%）、苯及其取代衍生物（14.12%）、杂环化合物（13.31%）、有机酸及其衍生物（7.45%）等；负离子模式下主要为苯及其取代衍生物（15.61%）、氨基酸及其代谢产物（14.47%）、杂环化合物（14.00%）、有机酸及其衍生物（11.41%）等（图1）。

2.2 差异代谢物结果的判断

OPLS-DA模型分析结果如图2所示，通过200次的随机组合试验，发现正离子模式下模型R2X=0.457、Q2=0.675、R2Y=1.000，负离子模式下模型R2X=0.448、Q2=0.658、R2Y=1.000。2个模式下的Q2都大于0.500，表明模型有效；R2Y的P都低于0.005，表明该模型可根据VIP分析筛选差异代谢物。

2.3 差异代谢物火山图

利用t检验和变异系数法比较2组代谢产物之间的差异，在VIP+FC双重筛选条件下，对正、负离子模式下检测到的所有代谢物进行差异分析，采用火山图进行可视化展示（图3），CON组和PFF组在正、负离子模式下筛选出的差异表达代谢物分别为337、253个，其中正离子模式下差异代谢物有93个上调、244个下调，负离子模式下差异代谢物有44个上调、209个下调，部分差异代谢物如表4所示。

2.4 差异代谢物KEGG富集分析

对差异代谢物进行KEGG pathway富集分析，P越接近于0，表示富集越显著，图中点的大小代表富集到相应通路上的差异代谢物个数。由图4可知，正离子模式下的差异基因显著富集在初级胆汁酸生物合成（Primary bile acid biosynthesis）、氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation）、类固醇激素生物合成（Steroid hormone biosynthesis）等KEGG信号通路。负离子模式下的差异代谢物显著富集在初级胆汁酸生物合成（Primary bile acid biosynthesis）、甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism）、胆汁分泌（Bile secretion）等KEGG信号通路。综合分析发现，在正、负离子下胆汁酸相关差异代谢物显著下降，并显著富集在初级胆汁酸生物合成、胆汁分泌等KEGG信号通路。

3 讨论

本研究对饲喂基础日粮和发酵饲料的2组蛋鸡回肠内容物样本进行代谢组比较分析。结果显示，发酵饲料组蛋鸡肠道中590个代谢物发生显著变化，其中，正、负离子模式下筛选出的差异表达代谢物分别为337、253个。KEGG通路富集分析表明，代谢物主要与胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成等通路相关。初级胆汁酸在宿主脂质和脂溶性物质的消化代谢、抗氧化状态、胆固醇代谢和宿主-微生物相互作用中发挥重要作用。胆汁酸可与细胞质G蛋白偶联受体TGR5（TGR5/M-bar）和核法尼醇X受体（FXR）结合调节脂肪、葡萄糖和能量消耗的代谢［10］。Yang等［11］研究发现，通过饮食、粪便微生物菌群移植等方式调控胆汁酸、肠道菌群可以缓解炎症性肠病，表明肠道菌群和胆汁酸在肠道稳态和炎症中起着关键作用。本研究中，富集于胆汁分泌、初级胆汁酸生物合成通路的胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸、牛磺胆酸含量显著下降，且蛋鸡未出现消瘦、消化不良等症状。可能原因是试验对象为健康蛋鸡，其肠道处于正常状态，没有炎症发生，同时发酵饲料中益生菌可助力营养物质消化，因此胆汁酸分泌低于CON组，但其具体调控机制仍有待进一步研究。

本研究还发现PFF组中氨基酸及其代谢产物相比CON组差异显著。氨基酸在生物体中合成蛋白质不可或缺，并可影响代谢生理学和信号传导，在宿主与微生物互作中充当重要的角色。肠道微生物合成氨基酸是促进宿主氨基酸稳态的重要方式，Lin等［12］的研究发现，肠道微生物群可以合成多种营养必需氨基酸，这是氨基酸稳态的潜在调节因素。谷氨酸、精氨酸、脯氨酸可以在动物机体内相互转化，并发挥重要作用的生理作用［13］，例如，日粮丙氨酸补充剂改善了肉鸡的生长性能和肌肽含量，改善了抗氧化能力和肉质，上调了肌肽合成相关酶的基因表达［14］。谷氨酸在提高家禽生长性能、生产性能及饲料效率方面作用显著［15］。本研究发现，PFF组蛋鸡肠道中的异亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丙氨酸、苯丙氨酸-谷氨酸-缬氨酸-谷氨酸、亮氨酸-酪氨酸-苏氨酸-赖氨酸等物质显著上调，表明饲喂发酵饲料可以增加回肠中氨基酸含量，从而促进蛋鸡生长性能和生产性能。

4 小结

本研究运用非靶向代谢组学结合LC-MS的方法，研究了2种日粮模式下蛋鸡肠道内容物代谢产物的变化。结果表明，饲喂发酵饲料减少了蛋鸡回肠内容物胆酸、牛磺鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸等胆汁酸含量，增加了回肠中氨基酸的含量。

参考文献：

［1］ LV J， GUO L J， CHEN B X， et al. Effects of different probiotic fermented feeds on production performance and intestinal health of laying hens［J］. Poultry science， 2022， 101（2）： 101570.

［2］ LU Z J， ZENG N， JIANG S G， et al. Dietary replacement of soybean meal by fermented feedstuffs for aged laying hens：Effects on laying performance， egg quality， nutrient digestibility， intestinal health， follicle development， and biological parameters in a long-term feeding period［J］. Poultry science， 2023， 102（3）： 102478.

［3］ ZHU X， TAO L J， LIU H， et al. Effects of fermented feed on growth performance， immune organ indices， serum biochemical parameters， cecal odorous compound production， and the microbiota community in broilers［J］. Poultry science， 2023， 102（6）： 102629.

［4］ ZHANG A R， WEI M， YAN L， et al. Effects of feeding solid-state fermented wheat bran on growth performance and nutrient digestibility in broiler chickens［J］. Poultry science， 2022， 101（1）： 101402.

［5］ JOHNSON C H， IVANISEVIC J， SIUZDAK G. Metabolomics：Beyond biomarkers and towards mechanisms［J］. Nature reviews molecular cell biology， 2016， 17（7）： 451-459.

［6］ 郑倩婷， 孟立娜. 肠道菌群代谢产物对肠道免疫影响的研究进展［J］. 国际消化病杂志， 2021， 41（3）： 164-167.

［7］ HUANG L， REN P， OUYANG Z， et al. Effect of fermented feed on growth performance， holistic metabolism and fecal microbiota in weanling piglets［J］. Animal feed science and technology， 2020， 266： 114505.

［8］ CHEN L， DING H， ZHU Y， et al. Untargeted and targeted metabolomics identify metabolite biomarkers for Salmonella enteritidis in chicken meat［J］. Food chemistry， 2023， 409： 135294.

［9］ GUO W， XU L N， GUO X J， et al. The impacts of fermented feed on laying performance，egg quality，immune function，intestinal morphology and microbiota of laying hens in the late laying cycle［J］. Animal， 2022， 16（12）： 100676.

［10］ MCGLONE E R， BLOOM S R. Bile acids and the metabolic syndrome［J］. Annals of clinical biochemistry， 2019，56（3）：326-337.

［11］ YANG M， GU Y， LI L， et al. Bile acid-Gut microbiota axis in inflammatory bowel disease： From bench to bedside［J］. Nutrients， 2021， 13（9）： 3143.

［12］ LIN R， LIU W， PIAO M， et al. A review of the relationship between the gut microbiota and amino acid metabolism［J］. Amino acids， 2017， 49（12）： 2083-2090.

［13］ LI X， ZHENG S， WU G. Nutrition and metabolism of glutamate and glutamine in fish［J］. Amino acids， 2020， 52（5）： 671-691.

［14］ QI B， WANG J， MA Y B， et al. Effect of dietary β-alanine supplementation on growth performance， meat quality， carnosine content， and gene expression of carnosine-related enzymes in broilers［J］. Poultry science， 2018， 97（4）： 1220-1228.

［15］ HE W， FURUKAWA K， TOYOMIZU M， et al. Interorgan metabolism， nutritional impacts， and safety of dietary l-glutamate and l-glutamine in poultry［J］. Advances in experimental medicine and biology， 2021， 1332： 107-128.