苦瓜皂苷L调控PI3K/AKT通路促进内皮祖细胞增殖能力和内皮功能的实验研究

黄建明 刘滴 金道群 朱定君

摘要 目的： 探讨苦瓜皂苷L对内皮祖细胞（EPC）增殖能力和内皮功能的作用及机制。 方法： 体外分离、培养、鉴定外周血EPC。使用不同浓度苦瓜皂苷L处理EPC 24 h后，应用细胞计数试剂盒（CCK.8）法检测各组细胞活力。使用AutoDock Tools 5.6软件，分别以磷脂酰肌醇3.激酶（PI3K）和蛋白激酶B（AKT）为受体， 以药物分子苦瓜皂苷L为配体采用盲对接法进行分子对接。使用PI3K/AKT 抑制剂LY294002和最佳使用浓度的苦瓜皂苷L单独或同时处理EPC 24 h后检测各组细胞活力和磷酸化PI3K（p.PI3K）、磷酸化AKT（p.AKT）及磷酸化内皮型一氧化氮合酶（p.eNOS）表达水平。 结果： 与对照组比较，苦瓜皂苷L呈剂量依赖性地促进EPC增殖，且40 μmol/L的苦瓜皂苷L是最佳药物浓度。与对照组比较，LY294002可下调EPC细胞活力，苦瓜皂苷L可上调细胞活力。与苦瓜皂苷L组比较，共同使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低细胞活力。分子对接结果显示，苦瓜皂苷L与PI3K和AKT均存在直接作用，形成稳定的锁钥结构。与对照组比较，LY294002可显著下调p.PI3K、p.AKT和 p.eNOS蛋白水平；苦瓜皂苷L可上调p.PI3K、 p.AKT和p.eNOS蛋白水平。与苦瓜皂苷L组比较，使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低p.PI3K、p.AKT和p.eNOS蛋白水平。 结论： 苦瓜皂苷L通过PI3K/AKT信号通路靶向调节EPC的增殖能力，进而上调内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活化水平以促进EPC内皮功能。

关键词  内皮祖细胞；苦瓜皂苷L；细胞增殖；内皮功能；实验研究

doi：  10.12102/j.issn.1672.1349.2024.10.006

Experimental Study on the Regulation of PI3K/AKT Pathway by Momordicoside L  Promoting Endothelial Progenitor Cell Proliferation and Endothelial Function

HUANG Jianming， LIU Di， JIN Daoqun， ZHU Dingjun

Huangshi Central Hospital， Affiliated Hospital of Hubei Polytechnic University， Huangshi 435000， Hubei， China

Corresponding Author  ZHU Dingjun， E.mail： djzhu2005@163.com

Abstract Objective： To explore the effect of Momordicoside L on endothelial progenitor cells（EPC） proliferation and endothelial function and its mechanism.  Methods： Peripheral blood EPCs were isolated，cultured，and identified in vitro.After EPC was treated with different concentrations of Momordicoside L for 24 h，cell viability was detected by cell count（CCK.8）.By AutoDock Tools 5.6 software，the molecular docking was performed by blind docking method with phosphatidylinositol 3.kinase（PI3K） and protein kinase B（AKT） as receptors，and the drug molecule Momordicoside L as ligand.The cell viability and the expressions of phosphorylated PI3K（p.PI3K），phosphorylated AKT（p.AKT） and phosphorylated endothelial nitric oxide synthase（p.eNOS） in each group were detected，when EPC was treated with PI3K/AKT inhibitor LY294002 and the optimal concentration of Momordicoside L alone or simultaneously for 24 h.  Results： Compared with control group，Momordicoside L could promote EPC proliferation in a dose.dependent manner，and 40 μmol/L was the optimal concentration.Compared with the control group，LY294002 could down.regulate EPC cell viability，and Momordicoside L could up.regulate EPC cell viability.Compared with Momordicoside L group，the co.administration of Momordicoside L and LY294002 decreased cell viability.Molecular docking results showed that Momordicoside L had direct interaction with PI3K and AKT，and could form a stable lock key structure.Compared with the control group，LY294002 significantly down.regulated the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS.Momordicoside L up.regulated the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS. Compared with the Momordicoside L  group，the administration of Momordicoside L and LY294002 decreased the protein levels of p.PI3K，p.AKT and p.eNOS.  Conclusion： Momordicoside L could regulate the proliferation ability of EPC through the PI3K/AKT signaling pathway，and then up.regulate the activation level of endothelial nitric oxide synthase（eNOS） to promote endothelial function of EPC.

Keywords  endothelial progenitor cells; Momordicoside L; cell proliferation; endothelial function; experimental study

内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）是 起源于骨髓的多能干细胞，可定向分化为内皮细胞，参与血管生成和损伤修复  ［1］ 。已证实在糖尿病、高血压、冠心病等慢性疾病中EPC水平下降，且功能受损  ［2.4］ 。Schmidt.Lucke等  ［5］ 研究显示，与稳定性冠心病病人比较，急性冠脉综合征病人循环血EPC数量显著减少，提示心血管急性缺血性事件的发生可能与EPC的数量呈负相关。本研究团队前期研究发现，与绝经前女性组比较，绝经后女性血清雌二醇水平与外周血EPC数量均明显降低，这可能是女性绝经后心血管病风险升高的危险因素之一  ［6］ 。目前尚无安全的治疗措施显著升高外周循环中EPC水平。苦瓜皂苷L是苦瓜总皂苷的主要活性成分，具有抗炎、降糖、调脂的作用，可能成为预防糖尿病、高血压及高脂血症的膳食补剂。有研究显示，苦瓜皂苷L对细胞增殖、分化、迁移具有较好的作用  ［7.8］ 。然而，苦瓜皂苷L对EPC增殖能力的影响研究较少。本研究结合生物信息学、细胞生物学及分子生物学综合探讨苦瓜皂苷L对EPC增殖能力和内皮功能的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

苦瓜皂苷L（T10N8Z47950）购自上海源叶生物科技有限公司；内皮细胞培养基（ECM，中乔新舟公司）；人纤维连接蛋白（Millipore Chemicon公司）；Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（ac.LDL.Dil，Sigma公司）；图谱FITC标记的荆豆凝集素Ⅰ（FITC.UEA.Ⅰ，Sigma公司）；细胞计数试剂盒8（CCK.8，Dojindo公司）；二甲基亚砜（DMSO，碧云天公司）；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS.PAGE）试剂盒（塞维尔公司）；磷酸化磷脂酰肌醇3.激酶（p.PI3K，#17366）、 磷酸化蛋白激酶B（p.AKT，#4060）、磷酸化内皮型一氧化氮合酶 （p.eNOS）（#9570）均购自Cell Signaling Technology公司。

1.2 EPC培养及鉴定

本研究团队前期已从兔 外周血中分离得到EPC，本次实验继续培养EPC并采用FITC.UEA.Ⅰ和ac.LDL.Dil 双染法鉴定EPC纯度  ［9］ 。使用ac.LDL.Dil（10 μg/mL）于37 ℃下孵育细胞1 h后，使用2%多聚甲醛固定细胞10 min，使用磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗3次。加入FITC.UEA.Ⅰ（10 g/mL）于37 ℃孵育1 h后，使用PBS清洗3次以减少假阳性。使用激光共聚焦显微镜分别激发绿色荧光（波长477 nm）和红色荧光（波长543 mm），并保存照片。

1.3 细胞分组及处理

首先将贴壁的EPC随机分为6组（对照组及不同浓度的苦瓜皂苷L组），以每孔1×10 4的密度均匀铺于96孔板上，每组5个复孔。24 h后，分别使用0.1%DMSO和不同浓度的苦瓜皂苷L孵育24 h，检测苦瓜皂苷L对EPC活力的影响。将贴壁的EPC随机分为4组，分别以每孔1×10 4和5×10 5的密度均匀铺于96孔板和6孔板。24 h后，分别使用DMSO（对照组）、磷脂酰肌醇3.激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）抑制剂LY294002（LY294002组）、苦瓜皂苷L（苦瓜皂苷L组）及苦瓜皂苷L＋LY294002（苦瓜皂苷L＋LY294002组）孵育24 h，进行细胞活力检测和分子学分析。

1.4 增殖能力检测

使用CCK.8测定细胞增殖能力，操作步骤按照说明书进行。于96孔板细胞孔内每孔匀速加入10 μL CCK.8试剂，于37 ℃、5%CO 2培养箱中培养1～2 h后，使用酶标仪于490 nm波长条件下检测OD值。

1.5 生物信息学预测

使用AutoDock Tools 5.6软件工具，分别以PI3K和AKT为受体，以药物分子苦瓜皂苷L为配体采用盲对接法进行分子对接。根据蛋白活性口袋设置对接盒子坐标和大小，进行分子对接，其他按软件默认设置，最终得到结合构象文件和结合能，并通过PyMOL 1.8软件和Ligplot＋1.4对接构象进行可视化分析，得到相应的三维和二维结构图。

1.6 蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测

使用RIPA缓冲液、磷酸酶抑制剂A/B、苯甲基磺酰氟（PMSF）处理细胞30 min后于低温高速离心机下以14 000 r/min条件离心10 min，取上层澄清液体，测量蛋白浓度。将细胞裂解物于金属浴锅内以95 ℃变性10 min后，于－20 ℃冷藏保存。使用SDS.PAGE试剂盒分别配置分离胶及浓缩胶，经上样、电泳后，使用湿法转膜将蛋白印迹转移至硝酸纤维素膜。 将膜浸泡在封闭液内于室温下封闭1 h后，使用TBST清洗3次。分别使用p.PI3K、p.AKT、p.eNOS一抗以1∶1 000 比例与一抗稀释液配制成液体，将膜浸泡于相应的抗体液中，于4 ℃条件下摇床内孵育过夜。将已孵育好一抗的膜取出后清洗3次，于室温下孵育二抗2 h。于避光条件下，使用化学发光试剂浸润膜后于显影仪器下进行显像。

1.7 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行数据处理及统计分析，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（ x  ± s ）表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用LSD法分析。以 P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EPC的染色及鉴定结果

使用ac.LDL.Dil和FITC.UEA.Ⅰ双染色鉴定分离培养的EPC，详见图1。其中绿色荧光代表EPC与凝集素结合，红色荧光代表EPC摄取ac.LDL.Dil后，橙色荧光为双染色阳性的EPC，阳性率达95%以上。

2.2 苦瓜皂苷L对EPC细胞增殖能力的影响

苦瓜皂苷L的结构分子式详见图2。检测不同剂量苦瓜皂苷L对EPC细胞活力的影响，结果显示，苦瓜皂苷L可显著提高细胞活力，提示细胞增殖或功能显著上调，且作用呈剂量依赖性，详见图3。当苦瓜皂苷L浓度为40 μmol/L时上调细胞活力的效果最佳，因此，选择该浓度为后续实验使用浓度。为探讨苦瓜皂苷L发挥作用的具体机制，进一步使用LY294002作为PI3K/AKT抑制剂，结果显示，与对照组比较，LY294002处理EPC后可显著下调细胞活力，苦瓜皂苷L可显著上调细胞活力。与单独使用苦瓜皂苷L比较，共同使用苦瓜皂苷L和LY294002可降低苦瓜皂苷L对细胞活力的影响。详见图4。结果提示， 苦瓜皂苷L可有效促进EPC活力，其作用可能与PI3K/AKT 信号通路激活有关。

2.3 苦瓜皂苷L与PI3K、AKT的分子对接结果

使用生物信息学技术分析苦瓜皂苷L与PI3K、AKT之间的关系，明确作用靶点。苦瓜皂苷L与PI3K和AKT均可靶向结合，并形成结构稳定的锁钥结构，详见图5。提示其可靶向作用于PI3K和AKT。

2.4 苦瓜皂苷L对PI3K、AKT、eNOS的表达影响

为进一步明确苦瓜皂苷L对PI3K/AKT信号通路的作用机制，采用Western Blot检测PI3K、AKT及eNOS的磷酸化活化形式。与对照组比较，LY294002处理可下调p.PI3K、p.AKT 及p.eNOS水平，苦瓜皂苷L 处理可上调p.PI3K、p.AKT及p.eNOS水平。与单独使用苦瓜皂苷L比较，同时使用苦瓜皂苷L和LY294002处理EPC将降低细胞活力。详见图6。上述结果提示，苦瓜皂苷L对EPC活力的影响可能通过PI3K/AKT信号通路发挥作用。

3 讨 论

高血压、糖尿病、高脂血症及缺血性心肌病等急慢性疾病早期均导致内皮损伤或功能失调，进而影响脏器功能  ［10］ 。EPC已证实是内皮修复和血管新生的关键因素，升高特定人群的EPC水平可能成为心血管疾病病人的防治措施  ［11］ 。EPC增殖能力及其功能水平与细胞活力密切相关，促进其增殖水平和细胞功能可显著减少心血管不良事件的发生。本研究结果显示，苦瓜皂苷L可有效促进EPC增殖，通过生物信息学分析发现苦瓜皂苷L可靶向结合PI3K和AKT，促进两者的磷酸化，进而激活下游信号分子eNOS活化水平升高。结果提示：苦瓜皂苷L通过PI3K/AKT信号通路靶向调节EPC的增殖能力并上调eNOS活化水平促进内皮功能。

苦瓜（momordica charantia L.）作为一种草本植物已被食用、药用近千年，既往中医认为其具有祛暑退热、明目、解毒等功能，现代研究显示，其具有降糖、降脂、抗炎、抗溃疡及抗肿瘤等多种功效  ［12.13］ 。随着对其药理学的研究发现，目前已鉴定出苦瓜的生物活性成分包括三萜类化合物、皂苷、多肽、类黄酮及生物碱等  ［14］ 。苦瓜皂苷L主要存在于苦瓜根茎和果实中，是苦瓜皂苷类主要的葫芦烷型三萜类化合物。既往研究显示，苦瓜皂苷L可显著促进成骨细胞的增殖 能力，提高细胞活性  ［15］ 。本研究证实了苦瓜皂苷L经PI3K/AKT 信号通路促进EPC的增殖能力，其可上调eNOS水平，进而增强EPC细胞功能。苦瓜皂苷L可能成为升高EPC水平及功能的治疗措施。

PI3K/AKT信号通路已被证实在细胞增殖、迁移、细胞凋亡和血管生成等生理过程中发挥重要作用  ［16］ 。PI3K/AKT信号通路在动员和改善EPC的功能中发挥着重要作用  ［17］ 。Liu等  ［18］ 研究显示，趋化因子受体4无论在常氧还是缺氧/复氧条件下均可促进EPC增殖，并抑制细胞凋亡，上述作用可被PI3K/AKT抑制剂LY294002削弱，提示PI3K/AKT是调控EPC增殖的关键信号通路。本研究结果显示，使用苦瓜皂苷L可上调EPC的细胞活力， 使用LY294002可削弱苦瓜皂苷L 的促增殖作用，提示苦瓜皂苷L的促增殖作用可能依赖PI3K/AKT信号通路；生物信息学分析预测了其具有靶向调节PI3K和AKT的能力，进一步分子生物学分析证实了其作用依赖于PI3K/AKT信号通路的磷酸化激活。既往研究证明，激活PI3K/AKT信号通路可诱导下游eNOS磷酸化，进而促进EPC的细胞功能  ［19］ 。eNOS活化后具有调节EPC功能的作用，可催化L.精氨酸生成一氧化氮，参与调节血管收缩、舒张等生理作用，还可促进血管生成以应对组织缺血  ［20］ 。因此，eNOS认为是判断EPC功能的关键指标。同时本研究结果还显示，LY294002可抑制PI3K/AKT活性，降低eNOS活化水平，苦瓜皂苷L可显著上调eNOS磷酸化水平，且该作用可被LY294002削弱。

综上所述，苦瓜皂苷L通过PI3K/AKT信号通路靶向调节EPC的增殖能力，进而上调eNOS活化水平以促进EPC的内皮功能，这些作用可能对血管损伤修复和血管新生具有重要的临床意义。

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（收稿日期：2023.02.09）

（本文编辑 薛妮）