基于网络药理学、微阵列数据分析和分子对接探究四君子汤治疗缺血性心力衰竭的作用机制

庄震坤 李颖 陈宏昱 温妙愉 蔡景太 孙绪新 宋晓丹 张伟健 陈奕群 程红

摘要目的：通过网络药理学、微阵列数据分析和分子对接探讨四君子汤治疗缺血性心力衰竭的作用机制。方法：采用R软件对GEO数据库中下载的缺血性心力衰竭（HF）的微阵列数据进行分析；借助中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP）数据库获取四君子汤中4味中药的化学成分和作用靶点，利用网络药理学的方法获取四君子汤有效成分与心力衰竭的匹配靶点；通过Cytoscape（v3.2.1）软件和STRING数据库构建蛋白蛋白相互作用（PPI）网络；在R软件上使用clusterProfiler（v3.8）和DOSE（v3.6）软件包进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。最后，借助AutoDockTool、PyMOL软件进行预处理及分子对接。结果：通过对微阵列数据的分析，获得关于心力衰竭的371个差异表达基因（DEGs）。共筛选出四君子汤有效成分136种，活性成分所涉及的相关靶点4134个，对9个匹配靶点和5个重要化学成分进行后续分析，构建了“四君子汤心力衰竭”PPI网络。通过GO生物过程、KEGG富集分析，得到细胞对酸性化学物质的反应、有机羟基化合物转运、轴突再生、神经元投影再生、内质网腔、胶原三聚体、蛋白结合和局灶性黏附途径等重要生物学过程。分子对接显示核心成分柚皮素与核心靶点载脂蛋白B（APOB）、补体C1q结合蛋白（C1QB）对接良好。结论：四君子汤治疗缺血性心力衰竭的机制可能是多靶点、多途径的直接或间接作用，为后续的四君子汤药理机制研究提供了生物学依据。

关键词缺血性心力衰竭；四君子汤；网络药理学；分子对接；微阵列数据分析；作用机制

doi：10.12102/j.issn.16721349.2024.06.003

心力衰竭在世界范围内的发病率和死亡率正在不断上升。全世界2%的成年人患有慢性心力衰竭［1］。人一生中患心力衰竭的风险约为20%［2］。据估计，由于人口老龄化的进程和心血管疾病治疗水平的上升，心力衰竭的患病率在未来20年将增加25%［3］。虽然急性心肌梗死死亡率在过去的半个世纪中有所下降，但冠状动脉疾病存活者仍有继发缺血性心力衰竭（heartfailure，HF）的风险［4］。缺血性心脏病（IHD）引起的左心室重构可导致耗氧量增加和心肌收缩效率降低［5］。这些病理过程可以激活神经系统和激素分泌，进一步导致心力衰竭的发生［67］。目前，治疗射血分数降低的心力衰竭的药物包括利尿剂、血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）、血管紧张素受体阻滞剂（ARB）、β受体阻滞剂、醛固酮受体拮抗剂（MRAs）以及近年出现的血管紧张素受体阻滞剂凝血素抑制剂（ARNI）［8］。

中医药在临床实践中积累了许多经验，在治疗慢性疾病方面有着重要地位。心力衰竭可归属于中医学“胸闷”“心悸”“水肿”和“喘证”等范畴。中医治疗心力衰竭有着悠久历史，多项研究表明，中医药治疗心力衰竭可以改善病人的水肿、气短、头晕、心悸等症状［911］。四君子汤是补气的代表方，广泛应用于脾气虚证的临床治疗，由人参、茯苓、白术、甘草4味中药组成。中医认为脾与心的关系极为密切，生理上，心主血行血，而脾为后天之本，气血生化之源，心脾共司血液的生成与运行。病理上，脾虚生化不足致心脉失于充盈，心脉不荣则引发胸闷、心悸等不适；二者脾虚不运，水湿不化，则发水肿、喘证。邱俊等［1213］通过构建慢性左心力衰竭小鼠模型，发现四君子汤可能通过调节能量代谢、减少心肌重构、提高收缩功能而改善慢性左心力衰竭模型大鼠的心功能。刘聪聪［14］研究表明，四君子汤合丹参饮可以显著改善射血分数正常的心力衰竭病人心功能和射血分数，降低N末端脑钠肽前体（NTproBNP）水平。陈正瑜等［15］研究发现，四君子汤加减联合常规治疗慢性心力衰竭气虚痰瘀证，能改善病人左心室射血分数、每搏输出量、心排血量及中医证候。然而，目前四君子汤治疗心力衰竭的相关药理机制仍未明确。

网络药理学是一种包含系统生物学、网络分析、连通性、冗余性和多效性的方法学研究［1617］。中医理论与网络药理学的核心思想有很大的相通之处。因此，研究者为了进一步研究多靶点效应的机制，建立了一种新的“网络靶点、多组分”模式的中医药网络药理学方法。该方法可以为解释中医药治病机制提供新的方式［1822］。分子对接可以确定配体在靶蛋白上的结合位点［23］。因此，分子对接方法被广泛应用于探究中药活性成分与疾病靶点的结合机制［2426］。此外，微阵列数据可用于识别心力衰竭的差异表达基因（DEGs）。

本研究基于网络药理学、微阵列数据分析和分子对接的综合方法以阐明四君子汤治疗心力衰竭的作用机制，研究流程见图1。

1资料与方法

1.1心力衰竭差异表达基因的获取

在GEO数据库［27］中检索心力衰竭的差异表达基因，再运行R平台上的Limma软件包（3.11版）对其进行分析，其中logFC的绝对值＜1，校正后的P＜0.05，得到了心力衰竭的差异表达基因GSE16499，进而为基因表达实验的数据分析提供了一个完整的解决方案［2829］。基于心力衰竭的差异基因绘制相关的热图和火山图。

1.2四君子汤活性成分的获取

通过中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/index.php）搜集四君子汤的所有药物，包括人参、白术、茯苓、甘草。根据药代动力学中口服生物利用度（oralbioavailability，OB）＞30%，类药性（druglikeness，DL）＞0.18对四君子汤中的药物进行筛选［3031］，最终得到符合条件的活性成分。根据检索结果建立活性成分数据库，其中包含四君子汤的活性成分和每个活性成分对应的靶点，再将每个靶点名称转换为通用蛋白质资源符号（UniProt，http：//www.uniprot.org/），以供后续分析。

1.3构建四君子汤的活性成分和心力衰竭的共同作用靶点网络

利用四君子汤活性成分靶点数据库和心力衰竭疾病靶点数据库的两个基因集之间的交叉点绘制韦恩图。通过Cytoscape（3.2.1版）［32］软件构建四君子汤的活性成分和心力衰竭的共同作用靶点网络，成分和靶点用“节点（nodes）”表示，二者的关联用“边（edges）”编码。

1.4构建蛋白蛋白相互作用（PPI）网络

确定“四君子汤心力衰竭”共同靶点基因，所有靶点基因仅将物种限制为“智人”，设置综合得分＞0.4分，从中隐藏断开的节点，再通过字符串数据库（STRING）［33］（https：//stringdb.org/，11.0版）构建PPI网络［34］。

1.5基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析

为了探究“四君子汤心力衰竭”共同靶基因的生物学功能，将GO［35］与KEGG［36］富集结果在clusterProfiler平台上进行路径分析，优化生物术语分类和基因簇富集分析的过程［37］。DOSE提供了疾病本体（DO）术语之间的语义相似性计算（即将高通量数据中的分子发现转化为临床相关性的重要注释，以及允许生物学家从疾病角度探索疾病和基因功能相似性的基因）［38］。设置P＝0.05和Q＝0.05，通过Cytoscape软件构建目标基因分子功能和通路网络，加上MCODE插件从网络中筛选出关键模块（设置度截止＝2，节点分数截止＝0.2，K分数＝2，最大深度＝100）。

1.6分子对接

分子对接AutoDockVina（1.1.2版本）与其他6个商用的对接程序相比有更高的准确性［39］，本研究采用半柔性的分子对接，因为其更适用于中药化合物和蛋白质之间的对接［40］。在进行分子对接前，从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载化合物的结构，即配体，从UniProt（http：//www.uniprot.org/）下载匹配的靶蛋白，即受体；或使用SWISSMODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）［41］进行同源建模。在缺乏实验参考结构的情况下，评估3D蛋白质结构模型的质量对于确定模型的实用性和潜在应用至关重要［42］。分子对接的结果最后通过PyMOL（2.4.0版本）进行可视化处理［43］。

2结果

2.1心力衰竭差异表达基因

从GEO数据库中下载GSE16499微阵列数据，再在R平台上使用Limma包进行分析，发现共有371个差异表达基因。在这些基因中，183个基因被显著上调，188个基因被显著下调。详见图2。心力衰竭基因中上调量最大的20个基因和下调量最大的20个基因见图3。差异表达量最大的20个基因见表1。

2.2四君子汤活性成分

运用ADME中的OB和DL参数，从TCMSP数据库中共筛选出四君子汤中的136个有效成分，其中人参22个、白术7个、茯苓15个、甘草92个。对此136个活性化合物进行靶点捕捉，得到4134个相关靶点基因，其中人参748个、白术774个、茯苓121个、甘草2491个。

2.3四君子汤活性成分和心力衰竭的共同作用靶点

四君子汤和心力衰竭有9个共同的作用靶点，即可能在心力衰竭治疗中起作用的靶基因，这些靶点的节点度最高，分别是B淋巴细胞瘤2（BCL2）、花生四烯酸5脂加氧酶（ALOX5）、醛酮还原酶家族1成员C1（AKR1C1）、载脂蛋白B（APOB）、补体C1q结合蛋白（C1QB）、ABC亚家族G亚型2（ABCG2）、Ⅰ型胶原蛋白α1（COL1A1）、人组织型纤溶酶原激活剂（PLAT）、分泌型磷酸蛋白1（SPP1）。这些匹配基因对应四君子汤的5个活性成分（见表2），四君子汤中只有甘草和人参与这些匹配基因相关。图4展示了活性成分与心力衰竭的作用关系，网络中的节点度值（Degree）代表节点与其他节点的连接或边数，节点Degree≥5的成分有2种，分别是槲皮素（quercetin）和柚皮素（naringenin）。

2.4PPI网络

四君子汤与心力衰竭共同靶点的蛋白质蛋白质相互作用，每个连接都代表一种意义，比如蛋白质的同源性、基因共表达、基因的内在相关性。基因的相邻节点越多，重要性就越高。详见图5。Degree≥20个节点的关键基因见表3，其中≥40个节点的基因为TP53、BCL2和纤连蛋白1（FN1）。

2.5GO富集和KEGG通路分析

通过GO富集分析，共获得34个生物过程、26个细胞组分和2个分子功能。生物过程中P值排前4位的为细胞对酸性化学物质的反应（GO：0071229）、有机羟基化合物转运（GO：0015850）、轴突再生（GO：0031103）、神经元投射再生（GO：0031102）。细胞组分中内质网腔（GO：0005788）、胶原三聚体（GO：0005581）的P值居前2位；分子功能中蛋白质结合（GO：0005515）的P值最高。详见图6。从图7可以看到运用Cytoscape3.6.0软件构建的KEGG网络关系，其中，GO富集网络中靶点的Degree值见表4，Degree值≥3的GO生信条目见表5。图8是筛选出来的1个相关信号通路，即病灶黏附途径，其中富集的靶基因以橙色表示。

2.6分子对接

首先进行分子对接的受体蛋白的制备，关键靶基因对应的蛋白结构见表6。将关键靶基因与四君子汤中重要的有效成分进行分子对接，结合能分数按照评分进行评价，评分越低，配体分子与受体蛋白的结合力越强。其中柚皮素（naringenin）与APOB的结合、与C1QB的结合最强。从图9可以看出四君子汤中的5个有效成分与心力衰竭的9个靶点之间存在很强的相关性，得到的结合能分数见表7。

3讨论

本研究采用网络药理学、微阵列数据分析、分子对接等方法，探讨四君子汤治疗心力衰竭的作用机制。

3.1心力衰竭靶点数据库

从GEO数据库中下载GSE16499的微阵列数据集，分析得到了371个心力衰竭的差异表达基因，其中FCN3、SERPINA3和NPPA基因的P值最高。2013年Prohászka等［44］研究发现低水平的FCN3与心力衰竭的进展和结局相关。研究表明，SERPINA3基因参与了线粒体功能障碍和氧化磷酸化，可能成为心力衰竭新的诊断和治疗靶点［45］。NPPA基因编码心房利钠肽的合成［46］，其结构异常与心血管疾病的发病有因果关系，是预测心血管疾病发生的新兴标志物［47］。

3.2“四君子汤心力衰竭”的网络药理学

共筛选出四君子汤的有效成分136个，靶点4134个。选择其中的9个共同靶基因和对应的5个重要的有效成分进行后续分析，构建“四君子汤心力衰竭”PPI网络。共同靶基因为BCL2、ALOX5、AKR1C1、APOB、C1QB、ABCG2、COL1A1、PLAT和SPP1，重要的有效成分为β谷甾醇、山柰酚、皮苷、槲皮素和甘草查尔酮A，仅存在于甘草和人参中。甘草和附子配伍可减轻心力衰竭的大鼠细胞凋亡和心肌细胞损伤进程［4849］。有研究表明，含有人参的一些中成药在辅助治疗中可以使心力衰竭病人受益［50］。人参在转化生长因子β1（TGFβ1）/Smad3通路的调控下，可以改善异丙肾上腺素诱导的心肌纤维化和心力衰竭，其机制可能与钙调磷酸酶活化逆转有关［5152］。在这5个化合物中，槲皮素和山柰酚的节点度较高，表明四君子汤对心力衰竭的治疗具有重要作用。多酚类药物，特别是槲皮素，可以抑制内皮功能障碍，进而诱导一氧化氮生成［5354］。有大鼠实验证实山柰酚可延缓心肌细胞凋亡，并显著降低血管紧张素Ⅱ刺激心肌成纤维细胞引起的炎症和应激反应［5556］。柚皮素在小鼠实验中可以减轻心肌肥厚和间质纤维化，可能与抑制磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）和cJun氨基末端激酶（JNK）的信号通路有关［57］。β谷甾醇被认为具有抗氧化的心血管保护功能，广泛用于心力衰竭的治疗［58］。BCL2是一种影响细胞凋亡的原癌基因，在心力衰竭病人的心脏组织中发现其基因表达增加了近1倍［5960］。在小鼠实验中，有证据表明ALOX5表达的降低是减轻动脉粥样硬化的原因［61］。ALOX5变异基因型的亚群可以导致动脉粥样硬化［62］。AKR1C1已经被证实是一种新型左心力衰竭心肌生物标志物［63］。实验证实，APOB/载脂蛋白A1（APOA1）的比值与心力衰竭的疾病进展相关［64］。PPI网络显示，TP53、BCL2和FN1是3个最重要的节点。TP53已被证实可以调节心脏代谢，从而导致心力衰竭［65］。通过GO富集和KEGG通路分析获得了四君子治疗心力衰竭的关键BP、CC、MF和信号通路，包括细胞对酸性化学反应（GO：0071229）、有机羟基化合物运输（GO：0015850）、轴突再生（GO：0031103）、神经元投射再生（GO：0031102）、内质网腔（GO：0005788）、三聚胶原蛋白（GO：0005581）、蛋白结合（GO：0005515）和病灶黏附信号通路。既往有研究表明，小鼠心脏中病灶黏附信号通路的增强可能会损害心功能，在2型糖尿病心力衰竭的进展中发挥重要作用，以及在血管内皮生长因子相关的内皮细胞迁移中具有关键作用［6668］。

3.3分子对接

分子对接结果显示，柚皮素与APOB、C1QB的结合最强。有研究表明柚皮素与APOB有较强的结合活性，进而对脂质代谢产生影响［6970］。

综上所述，四君子汤可以通过多靶点、生物过程、细胞组分、分子功能和信号通路在多个水平上作用于心力衰竭，对心力衰竭的治疗有重要作用。

4结论

本研究应用网络药理学等方法，探索四君子汤治疗心力衰竭特别是缺血性心力衰竭的分子机制。通过微阵列数据分析，筛选出四君子汤的136个有效成分、4134个相关靶点以及心力衰竭的371个差异表达基因。发现四君子汤与心力衰竭之间有9个共同作用靶点，其中四君子汤中有5个有效成分与之相关。对关键靶点进行GO富集和KEGG通路分析发现，在生物过程中，细胞对酸性化学反应、有机羟基化合物转运、轴突再生和神经元投射再生的反应的重要性排在前4位；内质网腔、三聚胶原蛋白是排在前2位的细胞组分；蛋白质结合在分子功能分析中发挥了重要作用；病灶黏附信号通路是四君子汤治疗缺血性心力衰竭的主要途径。将14对化合物和靶蛋白通过AutoDockVina进行分子对接，结果表明这些配体和受体之间存在良好的结合活性。认为四君子汤治疗缺血性心力衰竭的机制可能是多靶点、多途径的直接或间接作用。本研究为四君子汤治疗心力衰竭的研究提供了新的方向。

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（收稿日期：20220108）

（本文编辑郭怀印）

基金项目国家自然科学基金项目（No.81573922）；深圳市医疗卫生三名工程（No.SZSM201612033）

作者单位1.广州