酶法制备植源性生物活性肽及其生理活性的研究进展

孟 烨，昝丽霞，2，3，张文夷，高 宁，杜小平，4

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西省四主体一联合茶产业校企联合研究中心，陕西 汉中 723000；3.陕西理工大学茶叶种植与加工研究所，陕西 汉中 723000；4.安康市富硒产品研发中心，陕西 安康 725028）

生物活性肽Bp（Bioactive peptides）是由2～20 个氨基酸组成的序列，分子量＜6 kDa，是源于蛋白质的功能性化合物[1]，其内含有人体自身无法合成的8种氨基酸，比例接近于FAO/WHO 的推荐模式，可供人体直接所吸收，具有抗氧化、降血压、降血脂、增强免疫力等功能，有助于维持机体健康和预防慢性疾病[2]。Bp 来源主要分为内源性Bp 和外源性Bp，内源性Bp 是由组织内特异性蛋白水解酶作用于各种功能性组织蛋白而产生的，是许多哺乳动物调节系统的介质；外源性Bp 是指人体以外的肽类物质，主要从食物中获取，在进入人体后先通过胃酸和胃蛋白酶将蛋白质分解成片段，然后在小肠中进一步分解为氨基酸和2～6个残基的寡肽，再经特异的转运系统进入小肠上皮细胞，从而释放到血液中[3-4]。目前Bp 的制备方法有酶解法、微生物发酵法和化学水解法三大类，不同的制备方法得到的肽的纯度、理化性质和功能活性不同，其中酶法制备的多肽易被人体消化吸收，且生产条件温和、易控制，因此最为常用。

食品加工行业的发展产生了大量的副产品，如小麦经加工制粉后的副产物麦麸、大豆制油后的豆粕或茶饮品加工后的茶渣等，这些副产物中都含有较高的膳食纤维、多糖和蛋白等功能成分，若将其当成饲料或废物处理，不仅资源浪费，还会对环境造成污染[5-7]，而利用酶解法可将食品加工行业的副产品制作成植物活性肽。因此，探讨植物活性肽的制备技术十分重要。基于此，本文在介绍酶法制备植物活性肽传统方法的基础上，讨论了酶法制备植物活性肽的技术改进，并对生物活性肽的生理活性研究最新进展进行了概述。

1 酶法制备植物活性肽的传统方法

酶法水解是目前提取植物多肽最常用的方法，适用于大规模生产，具有高效、安全和酶解过程可调控性的优点。酶法水解常用的蛋白酶有碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等，不同活性位点的蛋白酶对酶解速率、产物的生理活性及稳定性影响很大。如乔杨波等[8]用酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶分别对蚕豆蛋白进行酶解，发现胃蛋白酶水解产物的得率最高、菠萝蛋白酶的酶解产物具有良好的降血糖活性，而酸性蛋白酶的酶解产物具有良好的清除DPPH自由基效果。

酶法水解具体流程为原料处理、酶解反应、分离纯化和产品制备4步。原料处理是指清洗、破碎、浸泡等，目的是为了使材料成为更适合酶解的状态；酶解反应是酶解过程的核心，不同的材料都有其不同的酶解工艺，包括但不限于酶解温度、时间、酶用量等，反应结束要对其进行水浴灭酶处理；分离纯化是酶解工艺的重要步骤,其目的是将酶解产物与原料分离开来，并去除杂质；产品制备是将分离纯化后的酶进行浓缩、干燥、包装制成产品等。

在分离纯化过程中，Wasana Wongngam 等[9]就用超滤、粒径排除层析和反相层析分离玉米蛋白粉酶解产物，共发现了KLPPVGYP、QLVELLR、DLLGCS、AGCGAAVGTLQ、LSNPY、DPNTY 和LDDGAAKYPY 7 个新多肽。

2 酶法制备植物活性肽的技术改进

2.1 超声辅助蛋白酶解

超声波是指频率高于人类能听到的声音频率范围的机械波，频率＞20 kHz，输出源通常是一个振动体，并将机械振动转化为超声波能量，这些超声波能量以波的形式在液体、固体和气体等不同介质中传播。在对水解材料进行超声预处理或水解过程中使用高强度超声时，超声波的振动会通过影响液体中的氢键和疏水作用，间接地促使空化效应的产生。这些空化效应可能会进一步对蛋白质的疏水相互作用产生影响，导致蛋白质形态的改变，而这些改变可能更易于蛋白质特定位点被水解酶识别和结合，从而促进蛋白质的水解反应。Shanfen Huang 等[10]在玉米蛋白粉酶解时，引入了发散型超声和能量聚集型超声预处理方法，发现用频率为40 kHz 的发散型超声预处理1 h 比能量聚集型超声预处理得到的产物ACE 抑制活性更高，苦味肽浓度更低。陈妍等[11]采用超声联合碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白，结果表明超声处理增加了酶的速率常数，且产物具有较好的乳化活性和抗氧化活性。

2.2 微波辅助蛋白酶解

该法常常用于和蛋白酶一起提取植物多肽，当微波辐射通过样品中的溶剂时，水分子之间的摩擦和碰撞开始加剧，溶剂中的温度迅速升高，热能会传递到蛋白质分子内部，其氢键、非共价键等结构会受到热能的影响发生破坏，易于蛋白质裂解位点的暴露，从而导致蛋白质的快速分解[12]。于丽娜等[13]以冷榨花生蛋白粉为原料，优化了微波辅助酶解提取α-葡萄糖苷酶抑制肽的工艺，结果表明在微波功率为1 000 W、底物浓度9.77%、加酶量0.94%、温度59 ℃、pH 值为9.0 的条件下α-葡萄糖苷酶抑制率最高。Tian Shuangqi 等研究了微波辅助酶解制备的小麦胚芽多肽的理化性质和功能特性，表明微波辅助提高了体系反应速率，增加了多肽的产率和溶解度，且具有清除自由基的抗氧化功能。

2.3 高静水压辅助蛋白酶解

高静水压（HHP）辅助制备Bp，该法涉及对装载液体或固体食品的软包装材料施加适宜压力，诱导蛋白质展开，暴露出更多的活性位点，从而促进蛋白质的水解过程[14]。然而，加压和减压过程中会引发变形和复性等复杂的化学反应，这些反应可能导致蛋白质聚集或影响酶的活性和水解能力，而不能产生水解产物。Yu XinXin 等[15]在高压静水处理乳清蛋白对其结构的影响研究中就很好的证实了这一点，研究表明低压下表面游离SH 含量没有明显变化，压力上升到400～600 MPa时，表面游离SH 含量急剧增加，而在压力超过300 MPa时，总游离SH 含量显著下降，这说明了HHP 处理诱导的乳清蛋白结构改变可能涉及多种变性机制，包括展开和聚集。因此，HHP 参数及酶种类特性的不同都会对蛋白的水解度、Bp 的分子量分布极其功能特性具有一定影响。Muhammad Amer Nazir等[16]在不同高压静水条件下用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和Alcalase 制备甘薯血管紧张素I 转换酶抑制肽，在MW＜3 kDa 的肽段中，100 MPa 下Alcalase 制备的多肽比例最高，并从中鉴定出了5 个具有良好ACE 抑制活性的肽段。由于用HHP辅助蛋白酶解不需要使用高温或有机溶剂等对环境有害的条件，降低了生产成本和废物产生。已经发展为一种新颖、有效、环保的生物活性肽制备技术。

2.4 脉冲电场辅助蛋白酶解

脉冲电场辅助提取Bp 需要对样品施加短时高强度的电场，使细胞膜发生电穿孔，促进细胞内外物质的交换，包括酶的进入和目标生物活性肽的释放。同时极化蛋白质分子、破坏蛋白质四级结构中的非共价键来改变蛋白的构象，增强生物活性肽的产生[17]。脉冲电场参数的选择会直接影响到电场对细胞膜的作用强度和持续时间，进而影响生物活性肽的释放和提取效果。适当选择和优化脉冲电场参数可以在不损害样品的情况下提高生物活性肽的提取效率并增强多肽的活性。Zhang Shuyu 等[18]从松子蛋白中提取了RGAVLH 多肽，用脉冲电场处理松子肽RGAVLH，并与未处理的RGAVLH 相比，RGAVLH 的β-折叠结构发生了改变，暴露了活性位点，从而提高了免疫调节活性。Wang Ke等[19]以抗氧化活性为指标用响应面优化了脉冲电场处理10～30 kDa玉米肽的工艺条件，在电场强度15 kV/cm，脉冲频率为2 000 Hz的条件下，样品的结构和官能团都发生了改变，抗氧化活性提高了32.1%。

3 生物活性肽的生理活性

3.1 抗氧化

人体在代谢过程中会产生活性氧物质，活性氧的过量产生或清除能力不足可能导致氧化应激的累积，进而引发炎症、细胞损伤、组织衰老和器官功能下降。目前，抗氧化剂能在一定程度上帮助中和活性氧并减少氧化应激的损害，但长期或过量使用抗氧化剂会带来一些其他潜在危害。而生物活性肽中的氨基酸残基能够捕捉自由基，稳定其电子，从而保护细胞免受氧化损伤，因此，抗氧化肽作为天然抗氧化剂因其安全性高、吸收好、来源广泛而备受关注。

Shi Hui 等[20]从牛蒡中分离鉴定出了D2-G1S-1 和G2-G1S-2 两条多肽，均表现出强大的抗氧化活性，将其在秀丽隐杆线虫进行体内实验，结果表明这两条肽段均能在不以降低生物体生长为代价的前提下延长氧化应激抗性，减少脂肪、ROS 和脂褐素的积累，并能通过调节IGF-1 信号延长线虫的寿命。李琳等[21]研究了英国红芸豆抗氧化肽组分（BRKBPAPC）在斑马鱼体内的抗氧化作用，发现实验组斑马鱼体内的CAT、SOD 等多种抗氧化活性酶活力都得到了显著提高。高剂量的BRKBPAPC 还对AAPH 诱导的氧化应激起到到了改善作用。这些研究结果为抗氧化肽在食品、医药和化妆品等领域的开发研究提供了坚实的理论依据。

3.2 降血压

近年来，心血管疾病的死亡率急剧上升，而高血压期间血压升高被确定为是与心血管疾病密切相关的因素，因此，改善高血压成了降低心血管疾病相关死亡率的关键目标。人体内的肾素-血管紧张素系统（RSA）和激肽释放酶-激肽系统（KKS）是调节血压的主要途径，其中血管紧张素转换酶（ACE）是高血压发病的主要介质，主要功能是将血管紧张素I（Ang-I）转化为血管紧张素II（Ang-II）。Ang-II 能够收缩血管，增加血管阻力，导致血压升高[22]。而这些抗氧化肽肽对ACE 具有靶向作用，从而起到延缓血压升高的作用。Lu Xiang等从大蒜蛋白中提取出两条肽段（MGR 和HDCF）并在大鼠探究了两条肽段对RAS 的调控机制，结果表明MGR 和HDCF 可以抑制ACE-AngII-AT1 轴的新生激活，从而减少Ang-I 和Ang-II 的过量产生和血压升高。何海艳等[23]的研究表明，低于1 kDa 南瓜籽肽具有较好的降血压活性，对大鼠灌胃6 h 后能有效的降低收缩压21.42 mmHg左右，是一种良好的降血压功能食品原料。

3.3 降血糖

降血糖肽与α-葡萄糖苷酶作用的实质是通过多肽分子对多糖与酶之间的结合产生竞争，降低酶与多糖之间的结合率。从而减少葡萄糖的降解，达到降低血糖的作用。冯雪等人将提取的桑叶多肽喂养代谢紊乱的大鼠，通过测量血糖含量证实了其具有良好的降血糖效果。赵婉宏等[24]用以玉米蛋白粉为原料提取分离出的不同超滤组分的玉米肽喂养斑马鱼，在斑马鱼组织中BCA 含量、葡萄糖、甘油三酯、总胆固醇、高低密度脂蛋白的含量后发现＜1 ku 的组分对糖尿病斑马鱼糖脂指标改善效果最好，且该组分里具有调节血糖作用的亮氨酸和谷氨酸含量最高。

3.4 降尿酸

尿酸是人体内嘌呤代谢的产物，含量过高会导致痛风、肾脏疾病等各种疾病的发生。其产生机制是人体代谢产物中的次黄嘌呤被黄嘌呤氧化酶（XO）氧化为黄嘌呤，进而氧化为尿酸。降尿酸肽又称为黄嘌呤氧化酶抑制肽，可以通过抑制XO 的活性来降低黄嘌呤的氧化速率，达到降低尿酸含量的目的。Li Qingyong等[25]从核桃粕中提取出了WMH 和DWMH 两条新型降尿酸肽，DWMH 在大鼠体内与别嘌呤醇具有相似的降尿酸作用，且两条肽能促进肾功能衰竭的改善。降尿酸肽的相关研究起步较晚，且大多集中在鱼类，植源性食品中降尿酸肽的相关研究更是少之又少，这也为该领域的研究提供了机遇和挑战。

3.5 降血脂

血脂是机体代谢的能量来源，但当机体代谢出现异常时会引起血脂含量升高，并伴随多种并发症。胆固醇在肝中降解产生的胆汁酸有助于脂质在肠道的吸收，而Bp 能与胆汁酸结合，进而有效减少胆固醇的吸收。白宝清等[26]使用碱性蛋白酶对紫苏籽粕蛋白进行酶解，分离出3 个组分，用G2 组分灌胃高脂模型组小鼠，结果显示小鼠体内的TC（总胆固醇）、TG（甘油三酯）和LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇）含量明显降低，表明紫苏籽粕活性肽G2具有降血脂的功效。周亭屹等[27]将酶解的西兰花肽进行分离纯化和细胞实验筛选，将效果较好的凝胶分离组分G15-II 进行动物实验，发现高剂量组肽段G15-II 能降低大鼠血液TC 和TG 含量水平，同时提高HDL-C含量，可见西兰花肽具有明显的辅助降血脂作用。

4 结语

植物是生物活性肽提取的天然宝库，植源性生物活性肽因其特有的氨基酸组成将成为一类非常具有发展潜力的化合物。采用酶法制备植物多肽的好处不仅仅在于条件温和、安全性高，更重要的是不同的酶解条件可以产生不同的植物功能多肽并具有不同的产品性质。而酶法制备技术的创新更是提高了小分子多肽的得率，能有效增强植物多肽的功能活性。目前，在植源性生物活性肽的研究中，制备技术、结构鉴定和活性测定的方法相对成熟，且主要集中在体外活性测定和细胞内活性研究，植物活性肽在体内的作用机制和人体临床验证实验的研究还不够，无法将其作为功能性食品和药物进行商业化生产。未来的研究其功能活性和人类健康的关系上，提高生物活性肽的利用率。