基于网络药理学和分子对接探究“羌活-独活”治疗类风湿关节炎作用机制

吕娟 孙广瀚 万磊 李方泽 吴曙琳 熊瑛 张伊敏

*基金项目：国家自然科学基金面上项目（81973655）；国家自然科学基金面上项目（82274501）；2022 年湖南省教育厅科学研究项目（22C0684）

第一作者简介：吕娟（1990-），女，主治医师，研究方向：中西医结合防治风湿痛。

摘要：目的  基于网络药理学和分子对接探究“羌活-独活”治疗类风湿关节炎作用机制，为临床应用提供参考。方法  在TCMSP数据库以羌活、独活为关键词分别进行检索，利用GeneCard、Drugbank、TDD、OMIM四个数据库，以“rheumatoid arthritis”为关键词检索疾病相关靶点，利用R语言包VennDiagram将预测的羌活、独活活性靶点和收集的RA疾病相关靶点进行分析，获得共同靶点，将中药、化学成分和共同靶点上传至Cytoscape 3.6.0软件绘制中药-化学成分-药物疾病共同靶点网络图，使用Metascape数据库对共同靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，利用TCMSP数据库寻找关键活性成分的化合物分子结构，利用PDB数据库寻找核心作用靶点的蛋白质结构。结果  KEGG通路及GO生物过程富集结果显示，羌活、独活可能通过癌症通路、钙信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt 信号通路、cAMP 信号通路等信号通路治疗类风湿关节炎。分子功能主要体现在核受体活性、神经递质受体活性、肽酶活性、蛋白域特异性结合、蛋白质同二聚化活性。主要通过细胞器外膜、内吞囊泡、受体复合物、突触后膜、膜筏等传送物质，进行对类固醇激素的反应、对药物的反应、调节离子转运、凋亡信号通路的表达、血液循环、细胞对有机环状化合物等反应。选择NOS3、JUN、ESR1进行羌活-独活中有效成分β-谷甾醇、o-乙酰二氢欧山芹酯、蛇床夫内酯的分子对接，其中JUN与β-谷甾醇、o-乙酰二氢欧山芹酯、蛇床夫内酯表现出较强的结合活性。结论  基于基于网络药理学和分子对接探究“羌活-独活”治疗类风湿关节炎作用机制，羌活、独活可能通过抑制细胞增殖，雌激素作用反应等治疗类风湿关节炎。

关键词：羌活；独活；网络药理学；分子对接

中图分类号：R684.3    文献标志码：A    文章编号：1007-2349（2024）05-0060-07

安徽徽州（今黄山市）辖一府六邑，医风昌盛，出现以汪机、徐春甫、孙一奎、程钟龄、程杏轩为代表的800余位新安医家［1］。痹病主要症状是关节疼痛，包含现代医学中类风湿关节炎等。《黄帝内经》中即揭示痹病的发病与风、寒、湿等气候因素密切相关，而新安地域多山，山林又多湿气，因此新安地区痹病的发病率居高，新安医家对痹病论述也较多［2］。

羌活和独活统称“二活”，是临床治疗痹病常用药对，都属于伞形科植物，均能祛风寒湿［3］，有研究表明药对羌活与独活能够在不同程度上显著性的减轻关节炎大鼠的足趾肿胀［4］。本文运用网络药理学及分子对接对“羌活-独活”治疗类风湿关节炎的作用机制进行探讨。

1  资料与方法

1.1  中药成分与作用靶点的筛选  利用TCMSP数据库（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以羌活、独活为关键词分别进行检索，以OB值≥30，DL值≥0.18为筛选标准，筛选出具有较高生物活性及利用价值的化学成分，并利用该数据库对筛选出的化学成分进行靶点预测。对于TCMSP无法预测的化学成分，查阅相关文献及利用PharmMapper数据库（http：//lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/）进行检索补充，选择可能性≥0.9的靶点蛋白。将靶点预测结果合并整理后，利用Uniprot数据库（Universal Protein，https：//www.uniprot.org/），以“reviewed”、“Homo sapiens”为筛选标准，将预测靶点的蛋白质名称转化为标准的基因名称，获得羌活、独活活性成分的相关作用靶点。

1.2  RA疾病相关靶点收集  利用GeneCard（http：//www.genecards.org/）、Drugbank（http：//go.drugbank.com/）、TDD（Therapeutic Target Database，http：/db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man，http：//omim.org/）四个数据库，以“rheumatoid arthritis”为关键词检索疾病相关靶点。将四个数据库得到的所有相关靶点合并、删除重复项，利用Uniprot数据库将整合后的靶点名称转化为标准的基因名称。

1.3  共同靶点筛选及PPI网络构建  利用R语言包VennDiagram将预测的羌活、独活活性靶点和收集的RA疾病相关靶点进行分析，获得共同靶点。将共同靶点上传至string数据库（http：//www.string-db.org/），物種设置为“Homo sapiens”，构建PPI网络，并将计算得到的tsv文件导入Cytoscape3.6.0软件，利用插件CytoHubba中MCC算法筛选出前10位基因并绘制相关网络图。

1.4  构建中药-化学成分-药物疾病共同靶点网络  将中药、化学成分和共同靶点上传至Cytoscape 3.6.0软件绘制中药-化学成分-药物疾病共同靶点网络图，并通过网络拓扑结构分析得出degree值排名前三的化学成分。

1.5  共同靶点富集分析  使用Metascape数据库（http：//metascape.org/）对共同靶点进行GO（Gene Ontology）功能富集分析及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，物种设置为“H.sapiens”，p值<0.01，最小计数为3，富集因子大于1.5，并根据富集分析结果利用R语言进行可视化处理。

1.6  分子对接结果验证  选取中药-化学成分-共同靶点网络中degree值排名前三的化学成分作为可能的关键化学成分，根据文献及现代研究筛选PPI网络图中NCA算法获得的靶点作为可能的核心作用靶点。利用TCMSP数据库寻找关键活性成分的化合物分子结构，利用PDB数据库（Protein Data Bank，http：//www1.rcsb.org/）寻找核心作用靶点的蛋白质结构。运用AutoDock Tools 1.5.6软件对化合物及蛋白质结构处理并进行柔性分子对接，以结合能作为对接结果的评判标准，验证羌活、独活治疗RA可能的关键化学成分和核心作用靶点，使用TBtools和pymol 3.7对所得结果可视化。

2  结果

2.1  羌活、独活治疗类风湿关节炎的网络药理学结果

2.1.1  羌活、独活活性成分及靶点的获取  通过TCMSP数据库，收集到有效化学成分羌活活性成分15个，独活9个，共有20個，重复4个（Nodakenin 紫花前胡苷、beta-sitosterol β-谷甾醇、 Isoimperatorin 异欧前胡素、Ammidin欧前胡素），见表1、2。

2.1.2  类风湿关节炎相关靶点的获取  汇总GeneCards，Drugbank，OMIM和TTD疾病数据库中有关类风湿关节炎的靶点，去除重复项，得到疾病相关靶点4165个。将羌活、独活活性成分的潜在作用靶点与类风湿关节炎疾病靶点输入Venny 2.1.0在线工具绘制韦恩图，取其交集后获得疾病-药物共同靶点35个，见图1。

2.1.3  羌活、独活治疗类风湿关节炎靶点-类风湿关节炎靶点网络互作图（PPI）构建  通过STRING数据库对交集靶点进行PPI分析，共涉及35个节点和114条边，见图2。运用CytoNCA插件和拓扑学参数，计算出BC、CC、DC、EC、LAC、NC的中位数，分别为20.190、0.436、6.000、0.078、1.667、3.583，其中均大于中位数的靶点共8个，见图3、表4。这些靶点在PPI中起着关键作用，是羌活、独活活性成分治疗类风湿关节炎的核心靶点。图2  羌活、独活治疗类风湿关节炎靶点-类风湿关节炎靶点网络互作图

图3  羌活、独活活性成分治疗类风湿关节炎的核心靶点

2.1.4  核心靶点的GO功能分析、KEGG通路分析  对羌活、独活共同靶点进行生物富集分析，得到GO功能富集条目652条，其中，生物过程（BP）545条、细胞组成（CC）30条和分子功能（MF）50条，经基因占比≥10%，BP选前20位后见图4。根据Metascape数

据库筛得到KEGG通路123条，可预测羌活、独活的治疗作用主要分布在癌症通路、钙信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt 信号通路、cAMP 信号通路等信号通路，见图5。

2.1.5  羌活、独活有效成分-类风湿关节炎核心靶点-信号通路网络图的构建  将羌活、独活的活性成分和其潜在作用靶点导入Cytoscape 3.8.2软件中，构建“成分-靶点-信号”网络图及“中药-有效成分-疾病靶点”网络，见图6、7。网络拓扑学分析结果显示，羌活、独活中degree值排名前三的活性成分为β-谷甾醇、o-乙酰二氢欧山芹酯、蛇床夫内酯这些活性成分可能为羌活独活治疗RA发挥疗效的主要活性成分。

2.2  分子对接分析  选择degree值排名前三位（≥10）的有效成分（β-谷甾醇、o-乙酰二氢欧山芹酯、蛇床夫内酯）与NCA算法及文献及现代研究筛选出的选择与靶点蛋白NOS3、JUN、ESR1进行分子对接。分子对接结果显示，β-谷甾醇和NOS3、JUN、ESR1靶点蛋白的结合分值分别为-10，-5.18，-8.39-kcal·mol-1，o-乙酰二氢欧山芹酯和NOS3、JUN、ESR1靶点蛋白的结合分值分别为-7.00，-4.89，-7.81 kcal·mol-1，蛇床夫内酯和NOS3、JUN、ESR1靶点蛋白的结合分值分别为-8.75，-3.74，-6.64 kcal·mol-1，表现出较强的结合活性，见图8；通过分子对接可视化图，说明β-谷甾醇、o-乙酰二氢欧山芹酯、蛇床夫内酯与NOS3、JUN、ESR1 3个靶点蛋白可自发结合，借助氢键等分子间作用力产生较稳定构象，分子对接可视化结果见图9。

3  讨论

羌活和独活统称“二活”，是中医药治疗痹病常用药对，蠲痹汤等经典名方就包含此对药。羌活味辛苦，性温，归膀胱经、肾经，《玉楸药解》记载其具有治疗“中风痿痹喁斜、关节挛痛、皮肤瘙痒、痈疽疥癞诸病［5］”。主要化学成分为香豆素类、聚炔类、酚酸类、生物碱类等化合物，现代药理学研究认为其具有抗炎抗菌、抗氧化、抗病毒活性、解热和镇痛等作用，主要在心血管系统、消化系统、中枢神经系统等方面有作用［6］。独活味辛苦，性微温，归膀胱经、肾经，《药性会元》记载其具有“治诸风掉眩，颈项难伸，风寒湿痹，两足不仁，疗诸风骨节疼痛［7］”的功效。主要化学成分为香豆素类、挥发油类等化合物，现代药理学研究认为其具有抗炎、抗氧化等作用［8］。羌活、独活相配伍，有学者提出在痹病初期即用大剂量有明显效果［9］，对于属中医痹病范畴的骨关节炎亦有良好效果［10］，能够在不同程度上显著性的减轻关节炎大鼠的足趾肿胀［4］。

网络药理学分析结果显示，PTGS2、CASP3、NOS3、HSP90AA1、JUN、ESR1、TGFB1、NOS2是羌活-独活治疗类风湿关节炎的关键靶点。类风湿性关节炎以滑膜细胞增生和血管翳形成为主要病理改变的自身免疫性疾病，而现阶段研究表明NOS3可释放的内皮型NO促进血管舒张，参与血管生成［11］。治疗类风湿关节炎的主要手段即抑制滑膜细胞增生，JNK通路與细胞坏死、凋亡有密切关系，贾庆运［12］即运用《医学心悟》中蠲痹汤及有效成分紫花前胡甙、紫云英苷治疗类风湿关节炎，猜想其有效的机制可能是通过抑制JNK、AP-1c-Jun的磷酸化相关。类风湿关节炎另一突出表现即女性发病率较高［13］，可能是女性体内雌激素通过增强IL-17的表达参与病程［14］，有研究表明雌二醇与ESR1的靶向结合可促进细胞增殖［15］。经上述相关文献研究，本文选择NOS3、JUN、ESR1进行羌活-独活中有效成分β-谷甾醇、o-乙酰二氢欧山芹酯、蛇床夫内酯的分子对接，其中JUN与β-谷甾醇、o-乙酰二氢欧山芹酯、蛇床夫内酯表现出最强的结合活性。

KEGG通路及GO生物过程富集结果显示，羌活、独活可能通过癌症通路、钙信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt 信号通路、cAMP 信号通路等信号通路治疗类风湿关节炎。分子功能主要体现在核受体活性、神经递质受体活性、肽酶活性、蛋白域特异性结合、蛋白质同二聚化活性。主要通过细胞器外膜、内吞囊泡、受体复合物、突触后膜、膜筏等传送物质，进行对类固醇激素的反应、对药物的反应、调节离子转运、凋亡信号通路的表达、血液循环、细胞对有机环状化合物等反应。

综上所述，本研究基于网络药理学及分子对接进一步探究作用机制。下一步将通过基础研究和临床应用进行验证。

参考文献：

［1］汪翔，郭静.试论新安医学儒医文化对中医教育的价值［J］.成都中医药大学学报（教育科学版），2021，23（1）：4-7+29.

［2］刘磊，刘健，许霞.新安医籍所载治疗痹证方用药特色分析［J］.中华中医药学刊，2015，33（12）：2841-2843.

［3］吕柳，刘洋.浅谈羌活与独活的区别［J］.天津中医药大学学报，2016，35（6）：425-427.

［4］刘晨，王英豪，陈智煌，等.药对羌活与独活及其单味药治疗佐剂关节炎初步研究［J］.辽宁中医药大学学报，2015，17（12）：20-22.

［5］李成文，刘彬.黄元御用药心法［M］.北京：中国中医药出版社，2017：161.

［6］马丽梅，杨军丽.羌活药材的化学成分和药理活性研究进展［J］.中草药，2021，52（19）：6111-6120.

［7］于永铎，于永敏，尹玲慧.药性会元［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，2018：3.

［8］周璐丽，曾建国.独活化学成分及药理活性研究进展［J］.中国现代中药，2019，21（12）：1739-1748.

［9］李勇.痹证初起重用羌活、独活治疗体会［J］.中医临床研究，2012，4（16）：75.

［10］沈鸿，穆兰澄，汪芳，等.羌活-独活在外用药活血散中的作用［J］.中国实验方剂学杂志，2018，24（15）：228-234.

［11］孙婷，池晴佳，王贵学.NOS3参与心血管疾病调控机制研究进展［J］.生物医学工程学杂志，2016，33（1）：188-192.

［12］贾庆运.蠲痹汤治疗类风湿关节炎的临床疗效观察及作用机制探讨［D］.上海：上海中医药大学，2019.

［13］叶冬青，沈冲，徐建华.类风湿关节炎危险因素探索［J］.中国卫生统计，2001（6）：14-17.

［14］祝静，晏波，蒋瑶，等.女性类风湿关节炎患者miR-146a、miR-23b的表达及雌激素对其的影响［J］.川北医学院学报，2020，35（4）：637-641.

［15］刘敏，谢巍伟，郑维，等.雌二醇与ESR1靶向结合通过ERK信号通路调控软骨细胞的增殖［J］.南方医科大学学报，2019，39（2）：134-143.

（收稿日期：2023-08-10）