超细粉碎联合半仿生技术处理的没食子残留物物理性质和生物活性分析*

艾 林，李 恺，刘 捷，张若冰

（1.中国人民解放军空军军医大学空军第九八六医院，陕西 西安 710054；2.陕西省药品监督管理局，陕西 西安 710065）

中草药的药物活性成分主要存在于细胞质和细胞核间［1-2］。目前，超细研磨技术可通过破坏细胞结构获得活性成分，快速、有效地发挥药物作用，广泛应用于中药加工［3-4］。振动式超声波研磨机可在短时间内对草药材料与研磨介质进行混合、强力粉碎、挤压和剪切，打破植物或动物药材的细胞壁，提高生物利用度，改变材料的物理和化学性质（包括水分含量、水溶性等）［5-6］。中草药半仿生提取方法模拟了药物通过胃肠道运输和吸收的环境，用不同pH值的溶剂和/或酶提取中草药中的活性成分，最大限度地发挥中药成分的功效，具有良好的应用前景［7］。中药没食子是一种在壳斗科Fagaceae植物没食子树Quercus infectioriaOlivier 上产生的幼虫虫瘿Cynips gallae tinctoriaeOlivier［8-9］。没食子的有效成分没食子酸及其衍生物具有多种药用和工业用途，具有抗肿瘤、抗过敏、抗动脉硬化、抗血管生成、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗炎、防辐射等作用［10］。研究表明，通过优化提取方法获得的没食子残留物（RTG）中含有没食子酸和鞣花酸，可利用没食子废渣制成生物炭吸附苯酚污染物，实现废渣的资源化利用［11-12］。目前，半仿生技术和振动型超声波研磨联合应用对RTG 的影响还未见报道。因此，本研究中采用半仿生技术对振动型超声波研磨的RTG 进行处理，探讨经半仿生技术提取的RTG的物理性质和活性成分的变化，以及RTG的抗氧化能力，为后续将RTG 进行二次开发提供理论依据，同时为提高没食子的药用产品质量提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：LMJ400型超细振动研磨机（无锡富岛科技股份有限公司）；S3500 型粒度分析仪（美国Microtrac 股份有限公司）；D180 型CO2培养箱（深圳市瑞沃徳生命科技有限公司）；IX71型倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（江苏新春兰科学仪器有限公司）；S3500 型粒度分析仪（美国Microtrac 股份有限公司）；Multiskan FC 型酶标仪（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）。

试药：没食子（中国新疆奇康哈博维药有限责任公司，批号为20161112）；2，4，6-三（2-吡啶）-1，3，5-三嗪（TPTZ，批号为T1253），1，1-二苯基-2-苦味酸肼自由基（DPPH，批号为300267），水杨酸标准液（批号为W398500），Folin-Ciocalteu 酚试剂（批号为F9252），DMEM 培养基（批号为D0822），胎牛血清（FBS，批号为TMS-016），2，3-双（2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基）-2H-四氮唑-5-甲酰苯胺（XTT，批号为X4251），均购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；青霉素钠（爱必信＜上海＞生物科技有限公司，批号为abs47048009）；水为纯净水；其他试剂均为分析纯。

细胞：菌株牙龈单胞卟啉菌（ATCC 33277，P.gingivalis）和变形链球菌（ATCC 25175，S.mutans）由中国人民解放军空军军医大学第九八六医院检验科惠赠。

1.2 样品处理与分组

样品处理：利用粉碎机粉碎没食子，按料液比1∶10（g/ mL）加水，于80 ℃温度下浸提3 次，每次1 h，水提后，得残留物，干燥，得RTG。利用圆盘研磨机粗磨，在25 ℃温度下超细研磨机研磨成粉末。

分组：使用不同直径的筛子进行筛分RTG 粉末，利用粒度分析仪按颗粒粒径分为A 组（＜100 µm RTG）、B 组（100～300 µm RTG）和C 组（＞300 µm RTG），每个粉末样品至少记录3 次测量结果。取浓盐酸234 mL，用水稀释至1 000 mL，置1 000 mL 容量瓶中，加16.4 mL 稀盐酸和800 mL 水，充分混合，振荡，加水稀释至1 000 mL，得盐酸缓冲液（pH=2）。取不同粒径RTG 样品各1 g，精密称定，分别加50 mL 盐酸缓冲液和纯净水，置37 ℃恒温防光水浴中保持30 min，滤过，得盐酸缓冲液组和水处理组溶液。以不含RTG 的水或盐酸缓冲液为基线组。

1.3 物理性质

RTG 水分：清洗称量皿，烘干至恒定质量，称取样品，放入100～105 ℃的烘箱中静置1.5 h，冷却后称定质量，再次烘干0.5 h，至恒定质量，计算水分。水分（%）=（G2-G1）/W。式中，G1为烘干至恒定质量后称量皿的质量（g），G2为烘干至恒定质量后称量皿和样品的质量（g），W为样品质量（g）。

总灰分：取不同粒径RTG 样品（1 ± 0.1）g，均匀摊平在预先灼烧至质量恒定的灰皿中，放入预热不超过100 ℃的马弗炉中缓慢升温至约500 ℃，保持30 min后继续升至（815±10）℃，灼烧1 h后冷却5 min，置干燥器中冷却至室温，至恒定质量。以最后1次灼烧后的质量为计算依据。

水溶性试验：将RTG 样品分散在蒸馏水中（1∶50，m/V），并于40，60，80，100 ℃温度的水浴中混合45 min，离心（转速为4 000 r/min）20 min［13］，取上清液，干燥，称定质量，计算水溶性指数（WSI）。WSI（%）=A/B×100%。式中，A 为干燥后上清液的质量（g），B为粉末的质量（g）。

其他物理性质：采用智能粉末积分仪检测RTG 样品的休止角、滑动角、碰撞角、体积密度、振实密度等物理特性。每次至少重复测试3次。

RTG 样品总多酚含量（TPC）测定：取RTG 样品1 g，加50 mL 盐酸缓冲液和纯净水，于37 ℃的恒温防光水浴中保持30 min，滤过，获得提取物，稀释，测定TPC。挥发提取物，用无菌水溶解，0.22µm 微孔无菌滤膜滤过，用于抑菌试验。

细胞增殖试验：选取患者7例，其中男3例，女4例；年龄（15.4±3.6）岁。收集7 例患者拔除的正畸前磨牙和/或第三磨牙，搔刮牙根获得正常牙周组织，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后剪为1～2 mm3的组织块。本研究方案已获中国人民解放军空军军医大学第九八六医院医学伦理委员会批准（批件号为202108006）。置DMEM（含50 mg/ mL 庆大霉素、50 mg/ mL 两性霉素B 和10%FBS）培养基中，于CO2培养箱（5%CO2、37 ℃、饱和湿度）中培养至贴壁生长。采用胰蛋白酶消化法（2%胰蛋白酶，0.2%EDTA）消化收集人齿根膜韧带成纤维细胞（HPDLF），传代培养，取第2～3 代的HPDLF 试验。将HPDLF 以105个/ mL 接种于96 孔板，加入100 µL DMEM 和10% FBS，CO2培养箱（5% CO2、37 ℃、饱和湿度）孵育24 h。去培养基，加入试验样品，静置2 h，吸弃溶液。将XTT 试剂加入孔中，37 ℃温度下孵育4 h，于510 nm 波长处测定光密度（OD510），每组重复测量3 次，计算平均值。

抗氧化能力：1）自由基清除试验。将0.1 mmol/ L DPPH 溶解于100%乙醇中，取100 µL，置100%乙醇（0.12～1.65 mg/mL）中，并与100 µL 新制备的DPPH充分混合，避光孵育30 min，记录OD510。计算清除DPPH 自由基的能力。DPPH（%）=Ai-（A-Aj）/Ai。式中，Ai为没有样品的DPPH 溶液的吸光度，A为与DPPH溶液混合的测试样品的吸光度，Aj为没有DPPH 溶液样品的吸光度。本研究中采用半数抑制浓度（IC50）对RTG的抗氧化活性进行分析，IC50值越低，抗氧化活性越强。2）羟基自由基清除试验。取10 mmol/ L FeSO41 mL、10 mmol/L水杨酸乙醇溶液1 mL、0.31～2.83 g/mL的RTG提取物溶液1 mL、30%H2O2200µL置试管中混合，振荡，于37 ℃水浴中孵育45 min，冷却后测量OD510，计算羟基自由基清除活性（HRSA）。HRSA（%）=（A0-A1）/A0× 100%。式中，A0为对照的吸光度，A1为测试样品的吸光度。采用IC50对RTG 的抗氧化活性进行分析，IC50值越低，抗氧化活性越强。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21.0 统计学软件分析。计量资料以X±s表示，组间比较采用方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般物理性质

随着RTG 粒径的增加（P＜0.05），水分含量降低，总灰分增加（P＜0.05），体积密度升高（P＜0.05），休止角度、滑动角度和崩溃角度减小（P＜0.05），振实密度升高（P＞0.05）。详见表1。

表1 不同粒径RTG的一般物理性质Tab.1 General physical characteristics of RTG with different particle sizes

2.2 水溶性

于40，60，80，100 ℃下，不同粒径RTG在1 h内的水溶性曲线见图1。颗粒粒径相同时，水溶性随温度的升高而升高（P＜0.05）；温度相同时，水溶性随粒径的增加而降低（P＜0.05）。

图1 不同粒径对RTG水溶性的影响注：不同粒径两两比较，aP ＜ 0.05；不同温度两两比较，bP ＜0.05。Fig.1 Effects of RTG with different particle sizes on WSINote：Two-by-two comparisons for different particle sizes，aP ＜ 0.05；two-by-two comparisons for different temperature groups，bP ＜0.05.

2.3 总多酚含量

盐酸缓冲液组总多酚含量显著高于水处理组（P＜0.05），B 组和C 组总多酚含量均显著高于A 组（P＜0.05）。详见图2。

图2 不同处理条件下RTG中总多酚含量注：与水处理组比较，cP ＜0.05。图3、图5、图6同。Fig.2 Total polyphenol content in RTG under different treatment conditionsNote：Compared with those in the water treatment group，cP ＜0.05（for Fig.2-3，and Fig.5-6）.

2.4 细胞增殖

与基线组比较，经水处理后的A 组和B 组的OD510显著升高（P＜0.05），盐酸缓冲液组的OD510值显著升高（P＜0.05），且粒径越小，增殖作用越明显（P＜0.05）；与水处理组比较，盐酸缓冲液组的OD510值显著升高（P＜0.05）。详见图3和图4。

图3 不同处理条件下细胞增殖情况（×40）Fig.3 Cell proliferation under different treatment conditions（× 40）

图4 不同处理条件下RTG细胞增殖情况注：与C组比较，dP ＜0.05；与基线组比较，eP ＜0.05。Fig.4 Effects of RTG on cell proliferation under different treatment conditionsNote：Compared with those in group C，dP ＜ 0.05；Compared with those in the baseline group，eP ＜0.05.

2.5 抗氧化活性

DPPH 自由基清除活性：随着粒径的增加，清除活性减小（P＜0.05）；盐酸缓冲液组清除活性显著优于水处理组（P＜0.05）。详见图5。

图5 不同处理条件下RTG的DPPH自由基清除活性Fig.5 DPPH radical scavenging activity of RTG under different treatment conditions

羟基自由基清除活性：随着粒径的减小，清除活性增加（P＜0.05）；盐酸缓冲液处理组清除活性显著优于水处理组（P＜0.05）。详见图6。

图6 不同处理条件下RTG的羟基自由基清除活性Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of RTG under different treatment conditions

3 讨论

3.1 对RTG 物理性质的影响

近年来，超细研磨技术在中药加工中得到了广泛应用［14］，在农业、电子材料、节能技术和其他行业中发挥了越来越重要的作用［15-16］。振动式超声波研磨机可改变材料的物理和化学性质，包括水分含量、水溶性等［17］。超细研磨会导致药物的物理和生物特性发生重要变化，提高机体的吸收率和生物利用度，增强疗效，减少毒副作用［18-19］。

不同粒径RTG 的水分含量随粒径的减少而增加（P＜0.05）。推测是由于较大的比表面积促进与空气中水分的吸收。高温燃烧后，有机成分挥发后剩余的无机成分为纯灰烬，小颗粒尺寸允许完全燃烧，颗粒直径小的总灰分含量较少。

本研究结果显示，当平均粒径减小时，RTG 的体积密度和振实密度均显著降低（P＜0.05），这可能是由于粒径的减小导致了颗粒间空隙的缩小。粒径小于100µm的粉末的休止角、滑动角和崩溃角均显著大于较大粒径的粉末（P＜0.05），表明经过超细研磨RTG 的流动性随颗粒尺寸的减小而减弱，推测可能是由于RTG在保湿后易凝结，聚合物倾向于以“金字塔”的角度排列。本研究结果显示，中草药粉末的质量可通过颗粒大小、体积密度、振实密度、流动性来控制。颗粒粒径相同时，水溶性随温度的升高而升高；温度相同时，水溶性随粒径的增加而减小。推测是由超细研磨后表面积和表面能的增加而导致。

3.2 对TRG 生物活性的影响

本研究中通过振动式超细研磨机制备了不同粒径的粉末，研究了不同粒径对RTG 成分、物理性能和抗氧化性能的影响。结果显示，超细研磨能有效降低RTG 的粒径、物理性质，包括含水量、水溶性、总灰分、体积密度、振实密度、休止角、滑动角和崩溃角，有助于产生DPPH、羟基自由基的清除活性。同时，本研究中采用半仿生技术提取RTG，采用XTT 法评估细胞增殖能力，通过测量线粒体脱氢酶活性，可显示细胞的生理状况信息。结果显示，RTG含有活性成分，且粒径越小增殖作用越明显，经盐酸缓冲液处理优于水处理。未来研究中将继续确定RTG是否可在更长时间内提高细胞活力。