基于网络药理学和设计空间优化黄芩提取工艺

摘要：通过超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱分析黄芩提取液的物质基础，从中鉴定出 了 26 个黄酮与黄酮醇类化合物，并以药物和疾病为导向，利用网络药理学筛选黄芩苷、野黄芩 苷、汉黄芩苷和汉黄芩素为主要活性成分。将这些物质的得率作为提取工艺优化的评价指标， 以先水提后醇提的方法，通过确定性筛选实验设计考察工艺参数对评价指标的影响，从而建立 黄芩提取的设计空间。实验设计的操作范围为：第 1 次提取时间为 35～45 min，液固比为 16～18 mg/L；第 2 次提取乙醇体积分数为 35%～45%，温度为 78～82 ℃，时间为 45 min，液固 比为 14～16 mg/L。实验结果表明本文提取工艺稳定可靠，提高了工艺研究与药物临床的相关 性，可为药物质量提升与工艺开发提供思路。

关键词：黄芩；超高效液相色谱-质谱联用；网络药理学；设计空间；提取工艺优化

中图分类号：R284.2

文献标志码：A

黄 芩 （ Scutellariae radix） 是 唇 形 科 植 物 黄 芩 Scutellaria baicalensis Georgi 的干燥根，最早被记载 于《神农本草经》，药用历史悠久，含有黄酮、挥发 油、多糖等化学成分，具有解热、抗炎、抗微生物、抗 氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种药理作用[1-2] ，药用价 值很高。随着中药现代化的发展，含有黄芩的药品 种类众多，剂型丰富，临床常用的含有黄芩提取物的 注射剂包括痰热清注射液、双黄连注射液、茵栀黄注 射液、清开灵注射液等，因其显著的疗效日益受到人 们的重视。

痰热清注射液由君药黄芩、臣药山羊角和熊胆 粉、佐药金银花、使药连翘提取加工而成，临床上主 要应用于急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、上 呼吸道感染、肺炎早期、下呼吸道感染和风温肺热病 等疾病[3] 的治疗，且自第 6 版国家《新型冠状病毒肺 炎诊疗方案》起被列入重症和危重病人的推荐用 药。黄芩作为君药在痰热清注射液的治疗中发挥着 主要作用，因此提升黄芩提取物的质量能够进一步 保障产品的质量与药效。

目前黄芩提取工艺的研究中，多数以黄芩苷为 指标成分进行工艺优选，但中药治疗疾病往往具有 多成分、多靶点协同调节的特点，因而黄芩的药效物 质可能由多种化学成分构成；此外，在网络药理学研 究中，基于数据库查找和筛选化学成分的方法具有 一定的局限性[4] ，忽略了对于化学成分“是否能被提 取出来”和“含量高低”的考虑。本文利用超高效液相 色谱-四级杆飞行时间质谱 （UPLC-Q/TOF-MS） 分析 和鉴定黄芩提取液的物质基础，并结合网络药理学 以疾病为导向探究黄芩提取液中的主要活性成分， 作为后续提取工艺优化的指标物质。相较于常用的 正交设计和响应面设计，工艺优化实验选用确定性 筛选的实验设计方法，可用较少的实验次数对多个 因素及其交互作用进行考察和筛选，并建立因素与 指标的定量模型[5] ，以此为基础进一步构建设计空 间，提高提取工艺的质量稳定性和操作灵活度。

1""" 仪器与材料

1.1 实验仪器

高分辨液质联用色谱仪，包括 ACQUITY UPLC I-Class PLUS 型超高效液相色谱和 Synapt XS 型四级 杆飞行时间质谱（美国 Waters 公司）；P230Ⅱ型高效 液相色谱仪（大连依利特分析仪器有限公司）；DF- 101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器（上海予华仪器 设备有限公司）；AL104 型分析天平（梅特勒-托利多 仪器有限公司）。

1.2 实验材料

黄芩饮片（由上海凯宝药业股份有限公司提供， 批号：2107204），于 50 ℃ 烘箱中烘干至恒重，再用中 药粉碎机粉碎，收集过 297 μm（50 目）筛网后的粉末 装入塑封袋中以备后用；黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩 苷、汉黄芩素购自北京索莱宝科技有限公司，黄芩 素、千层纸素 A 购自上海融禾医药科技发展有限公 司，白杨素购自中国药品生物制品检定所，试剂纯度 均≥98%；乙腈，色谱纯，美国霍尼韦尔国际有限公 司；甲酸，色谱纯，购自上海玻尔化学试剂有限公司； 水为娃哈哈纯净水。

2""" 方法与结果

2.1 黄芩提取液液质分析

2.1.1"" 黄芩提取液供试品的制备 精密称取黄芩药 材粉末 5.0 g，为充分获取黄芩中水溶性和醇溶性的 化学成分，先后以 10 倍的水和 70%（体积分数，下同） 乙醇溶液回流提取 2 次，水提温度为 95 ℃，醇提温度 为 80 ℃，每次 45 min，离心得到 2 次的提取液，合并 即得黄芩提取液供试品。

2.1.2"" 混合对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷、野 黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素、黄芩素、千层纸素 A 和白杨素对照品适量，置于 10.0 mL 容量瓶中，加 入甲醇超声使溶解，定容至刻度得混合对照品溶液。

2.1.3"" 液 质 条 件 ""色 谱 条 件 ： 色 谱 柱 为 Waters ACQUITY UPLC HSS T3 （2.1 mm×100 mm， 1.8 μm）， 流动相 A 相为 0.1%（体积分数，下同）甲酸水溶液， B 相为乙腈溶液 ，梯度洗脱 （0～2 min， 95%～80% A; 2～12" min，" 80%～65%A;" 12～14" min，" 65%～50%A;" 14～ 16 min， 50%～30%A; 16～18 min， 30%～5%A; 18～21 min， 5%A），体积流量 0.3 mL/min，柱温为 30 ℃，进样量 1 μL。

质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），负离子模 式检测。离子源温度 140 ℃，雾化压力 0.6 MPa，雾化 气体为氮气，碰撞能量 20～30 eV，雾化器温度 400 ℃， 雾化器流量 600 L/h，毛细管电压 2.5 kV。离子扫描 时间 1.0 s，扫描时间间隔 0.1 s，扫描范围：m/z 50～ 1200。

2.1.4"" 数据处理与成分鉴定 利用 MassLynx V4.1 软 件采集数据，负离子模式下黄芩提取液的总离子流 图如图 1 所示。根据准分子离子 [M-H]‾判断并得到 一级质谱精确相对分子质量，再根据二级质谱碎片 离子信息进一步与对照品或文献数据[3，6-7] 对照，或结 合软件中 Elemental composition 的功能对化合物的分 子式进行预测 ，利 用 Reaxys 数据库 （ https：//www. reaxys.com/#/search/quick） 和 Pubchem 平 台 （https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov） 进一步推导化合物结构 ， 共鉴定出黄芩中的 26 种成分，如表 1 所示。从黄芩 提取液中鉴定出的 26 个成分里，除黏毛黄芩素Ⅰ（化 合物 4）为黄酮醇类化合物，二氢黄芩苷（化合物 10） 为黄烷酮类化合物外，其余 24 个成分均为黄酮类化 合物，包括黄酮 O-糖苷和游离态黄酮。对于黄酮 O-糖苷类化合物 ， O-糖苷键断裂脱去葡萄糖醛酸 （−C6H8O6）后会出现 [M-H-176]‾碎片离子，如化合物 2 在 ESI ‾ 模式下的准分子离子为 m/z 461.0728 [M[1]H]‾，O-糖苷键断裂变成碎片离子 m/z 285.0426，经与 对照品的一级、二级质谱与保留时间对照后，确认为 野黄芩苷；化合物 16，在 ESI－ 模式下的准分子离子 为 m/z 329.0663 [M-H]‾，黄酮母核 A 环上的 2 个甲氧 取代基的 O−C 键断裂脱去 2 个−CH3 变成碎片离 子 m/z 299.0222，进一步发生 C 环的裂解变成碎片离 子 m/z 165.9925，对比文献[7] 后确定为黏毛黄芩素 II。

2.2 黄芩网络药理学研究

2.2.1"" 黄芩化学成分的筛选 不同于口服用药，注射 液可以不经过胃肠道吸收而直接进入人体血液，再 通过生物膜进入组织和细胞进一步发挥作用。根据 液质分析结果，在中药系统药理学数据库和分析平 台 （TCMSP， https：//tcmsp-e.com， 2020 年更新） 收集各 成分的化学信息，筛选相对分子质量 Mw≤500、类药 性 DL≥0.18、油水分配系数−2 ≤ lg P ≤ 5 的化合物。 黄芩提取物后续要溶于注射用水以配制注射液，因 此进一步利用Swiss ADME 平台（http：//www.swissadme. ch） 预测化合物的水溶性 lg S （ESOL）[8]。将筛选条件 定为−5lt;lg Slt;−1，得到 24 个化学成分，如表 2 所示。

2.2.2"" 黄芩化学成分的靶点收集 在 TCMSP 平台、 ChEMBL 平台（https：//www.ebi.ac.uk/chembl） 和Swiss[1]TargetPrediction 平台 （http：//www.swisstargetprediction. ch） 上获取 24 个黄芩中的化学成分的作用靶点，利 用 Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org）将靶点名 称转换为基因名，使数据标准化，得到黄芩对应的靶 点共 293 个。

2.2.3"" 疾病靶点的收集 将以痰热清注射液主治的 呼吸系统疾病和新冠肺炎及其重症作为研究对象， 在 Genecards 数据库 （ https：//www.genecards.org） 中 ， 分别以“acute bronchitis”，“acute episode of chronic bronchitis”，“upper respiratory infection”，“Pneumo[1]nia" in" the" early ” ， “Wind" warm" lung" fever ” ， “lower respiratory" infection ” ， “COVID-19 ” ， “novel coronavirus pneumonia ”和“COVID-19 severe”为关 键词，以 Relevance score 大于 10 为筛选条件，收集疾 病相关靶点共 2203 个，通过 UniProt 数据库转换为 基因名，使数据标准化。黄芩的主要化学成分的靶 点中有 146 个（即 49.8%）与痰热清注射液主治的呼 吸系统疾病以及新冠肺炎及其重症的靶点重合，这 些靶点是黄芩治疗疾病的潜在靶点，也是后续进一 步分析研究的对象。

2.2.4"" 蛋白质相互作用关系的研究及化学成分评 分 将黄芩化学成分和疾病的 146 个重合靶点输入 STRING 平台 （https：//string-db.org），获取蛋白间相互 关系 ，将源文件 以 tsv 格式导出后导 入 Cytoscape 3.8.2，利用 CytoHubba 插件中拓扑学网络算法里计算 能力较好的 MCC（Maximal Clique Centrality）法[9] 给 每个蛋白质赋值，数值大小表示该靶点在蛋白质网 络中的重要程度。利用 MCC 法的蛋白质评分结果 对黄芩中的主要活性成分进行评分，将每个化合物 对应的靶点与疾病靶点取交集，得到 n 个靶点，按式 （1） 进行计算，得到重要性排名前 10 的化合物，如表 3 所示。

其中：C 表示化合物重要性评分，Si 表示 MCC 法对各 个基因的评分结果，i=1，2，···，n。

2.2.5"" 黄芩中药-成分-疾病-靶点网络的构建 将中 药黄芩、24 个主要化学成分、7 种主治疾病、146 个 中药黄芩与疾病的重合靶点及各自之间的关系导入 Cytoscape 3.8.2，得到中药-成分-靶点-疾病网络 （如 图 2 所示）。其中，橙色方形代表中药黄芩，红色六边 形代表活性成分，蓝色圆形代表靶点，黄色菱形代表 疾病。

2.2.6"" 主要化学成分的靶点分析及分子对接 由表 3 中对黄芩化学成分的排名可见，黄芩苷、野黄芩苷、 汉黄芩素和汉黄芩苷排名靠前，且为黄芩中具有代 表性的黄酮类化合物。经液质分析及验证，这 4 种成 分在黄芩提取液中存在且含量相对较多，其药理学 作用及相关靶点的作用机制也已有诸多研究。为进 一步验证 4 种成分与疾病相关重要靶点间的结合性， 采用 AutoDock Tools 1.5.7 软件进行分子对接，结合 能小于 0 时，认为可在自然状态下对接，结合能越低 则对接状态越良好，分子对接结果如表 4所示，4 种成 分与选取的疾病相关靶点均有较好的结合能力。

4 种化合物均作用的靶点中 ，肿瘤坏死因子 （TNF）和醛酮还原酶 1B1（AKR1B1）与引发炎症反应 和促进细胞因子释放有关[10-11] ，黄芩可能通过抑制 TNF 受体和 AKR1B1 来减少由细胞因子及其他途径 诱发的炎症反应，从而发挥解热、抗炎作用。野黄芩 苷、汉黄芩苷和汉黄芩素可以作用于前列腺素内过 氧化物酶 PTGS2，该酶能在有害刺激引发急性炎症 反应时，调节前列腺素的形成与释放，而降低体内的 前列腺素水平能够达到解热止痛、抗炎消肿的效 果。黄芩苷、野黄芩苷和汉黄芩苷可通过调节白介 素 2 （IL-2） 来调节 T 细胞的增殖与分化，诱导杀伤细 胞的产生及活性，增强细胞免疫功能[12] ，维持体内环 境的平衡 ；新冠肺炎患者体内的促炎因子白介素 6（IL-6） 会异常升高而引发细胞因子风暴，导致机体 免疫功能失调，汉黄芩素则可以调节 IL-6 来发挥免 疫抗炎的功能。此外，咳喘、多痰也是呼吸系统疾病 与新冠肺炎的常见症状。表皮生长因子受体（EGFR） 被激活时会造成气道黏液分泌增多[13-14] ，而黄芩苷、 野黄芩苷和汉黄芩素可作用于该受体产生抑制作 用；气道黏膜中的胆碱能受体激动后也会增加黏液 的释放[14] ，黄芩苷、野黄芩苷和汉黄芩苷能作用于乙 酰胆碱酯酶（ACHE），降解乙酰胆碱从而防止受体激 动，起到止咳化痰的作用。

综上所述，黄芩中的主要活性成分黄芩苷、野黄 芩苷、汉黄芩苷和汉黄芩素能够发挥解热、抗炎、止 咳化痰、免疫调节等多种药理作用，通过调节体内环 境的平衡和提高机体免疫能力，来应对呼吸系统疾 病及新冠肺炎引发的各种临床症状。因此，将这 4 种 黄酮类成分作为后续提取工艺优化的评价指标。

2.3 黄芩提取工艺优化

2.3.1"" 黄芩提取物分析方法 采用高效液相色谱法 对黄芩提取物中的黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷和汉 黄芩素 4 种成分进行定性定量分析[15]。色谱条件：色 谱柱为 Waters Xterra Rp-C18（3.0 mm×100 mm， 3.5 μm）， 流动相 A 相为乙腈溶液，B 相为 0.1%（体积分数，下 同）甲酸水溶液，梯度洗脱 （0 ～ 10 min， 10% ～ 20%A; 10 ～ 30 min， 20% ～ 25%A; 30 ～ 60 min， 25% ～ 45%A），体积流量 0.4 mL/min，柱温为室温，紫外检测波长为 275 nm，进样量 10 μL，运行时间为 60 min。

2.3.2"" 黄芩提取液的制备方法 根据预实验结果，采 用先水提后醇提的方法提取黄芩中的活性成分。精 密称取黄芩药材粉末 5.0 g，先后用一定液固比的水 和 70% 乙醇回流提取 2 次，离心得到 2 次的提取液 后合并，得到黄芩提取液，用高效液相色谱测定提取 液中 4 种物质的含量。

2.3.3"" 确定性筛选实验设计及结果 采用确定性筛 选试验设计考察第 1 次提取时间（X1）、第 1 次液固 比（X2）、乙醇体积分数（X3）、第 2 次提取温度（X4）、 第 2 次提取时间（X5）和第 2 次液固比（X6）这 6 个工 艺参数 对 4 种指标物质提取效果的影响。利 用 JMP 软件（美国 SAS 公司）进行确定性筛选实验设 计，同时重复中心点实验 3 次，共进行 19 组实验，各 工艺参数的高低水平结合预实验和文献设定，实验 因素水平表和实验设计表及结果分别如表 5 和表 6 所示。黄芩提取的工艺评价指标为黄芩提取液中野 黄芩苷、黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的得率（分别 以 Y1、Y2、Y3、Y4 表示），这些指标物质的得率为指标 物质在提取液中和原料黄岑中的质量比。

2.3.4"" 数据处理与模型拟合 工艺评价指标 Y1～Y4 与 各工艺参数之间采用式 （2） 建立定量模型。

其中：a0 为常数；ai，aii 和 aij 分别为一次项、二次项与 交互项的回归系数；Xi 和 Xj 为各工艺参数；Yk（k=1， 2， 3， 4）为黄芩提取工艺评价指标。在 JMP 软件中通过 贝叶斯信息量准则结合逐步前进法进行拟合，模型 的回归系数和方差分析结果如表 7 所示。

由表 6 可见 ， 4 个工艺评价指标的模型均有 R 2gt;0.90，说明模型的拟合效果较好，可以较好地描述 工艺参数对指标的影响。4 个指标的预测值与实际 值的关系曲线如图 3 所示，图中黑点为指标的实际 值，红色直线为拟合模型，蓝色直线为实际值的均 值，浅红色面积内为 95% 置信区间。模型中工艺参 数及其交互作用的 P 值小于 0.05 时具有显著统计意 义，小于 0.01 时则表示影响非常显著。故根据回归 模型的分析结果，将 X1、X2 和 X3 确定为影响野黄芩 苷得率的关键工艺参数；将 X1、X2 和 X6 确定为影响 黄芩苷得率的关键工艺参数；将 X2、X3、X4 和 X6 确定 为影响汉黄芩苷得率的关键工艺参数；将 X2 和 X3 确定为影响汉黄芩素得率的关键工艺参数。

2.3.5"" 设计空间的建立及验证 采用达标概率法建 立设计空间，通过模拟实验测定误差法计算达标概 率，采用 Python 进行编程，具体编程思路参考论文 [16]。模拟次数为 5000 次，计算步长为 0.1，工艺评 价指标 Y1～Y4 的下限分别为 0.21%、15.10%、2.98% 和 0.19%，以最低可接受达标概率为 0.8 建立各指标 对应关键工艺参数的设计空间，设计空间的展示用 Origin 2018 软件绘制，如图 4 所示。

由图可见设计空间形状并不规则，且 Y1～Y4 4 个 指标各不相同。综合考虑 4 个指标的提取情况和操 作的便利性和经济性，最终确定推荐的操作范围为： 第 1 次提取 35～45 min，液固比为 16～18 mg/L，乙醇 体积分数为 35%～45%；第 2 次提取温度为 78～82 ℃， 时间为 45 min，液固比为 14～16 mg/L。在此操作范 围内，4 个指标皆满足工艺评价指标下限，且达标概 率为 0.95 以上。为进一步验证设计空间的准确性， 在设计空间内选择 3 个参数组合点进行实验验证，验 证实验的条件与结果见表 8，野黄芩苷、黄芩苷、汉 黄芩苷和汉黄芩素的得率全部达标，且实际值与预测值较为接近，说明本研究建立的设计空间比较可靠。

3""" 结 论

（1）通过对黄芩提取液的液质分析，从黄芩提取 液中鉴定出具有一定含量的 26 个黄酮、黄酮醇及黄 烷酮类化合物，并利用网络药理学，以药物和临床适 应症为导向，筛选黄芩的主要活性成分，发现黄芩 苷、野黄芩苷、汉黄芩苷和汉黄芩素能够发挥多重药 理作用来应对呼吸系统疾病及新冠肺炎引发的各种 临床症状，进而将这 4 种黄酮类成分作为后续提取工 艺优化的评价指标，改善多数工艺研究中与药物临 床相关性不足的弊端。

（2）采用确定性筛选实验设计方法，筛选出 4 种 与指标物质对应的关键工艺参数，建立工艺参数与 指标间的定量模型，以此为基础建立黄芩提取工艺 的达标概率设计空间，最终确定推荐的操作范围为： 第 1 次提取时间为 35～45 min，液固比为 16～18 mg/L； 第 2 次提取乙醇体积分数为 35%～45%，温度为 78～ 82 ℃，时间为 45 min，液固比为 14～16 mg/L。经验 证，工艺稳定可靠，可为实际的质量提升和工艺开发 提供思路。

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