BAZ1A在肝癌和子宫颈癌中的共同促癌机制分析

张千祎 郭纪敏 薛佳蕊 王淑青 刘岩，3

癌症不仅是全球主要死因之一，也是阻碍人类期望寿命延长的重要因素[1]。原发性肝癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，全球第六大常见恶性肿瘤，近几十年来发病率不断上升[2]。其中肝细胞癌是一种常见的肝癌类型，约占所有原发性肝癌病例的90%[3]。子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和高死亡率，对世界各地数百万妇女的健康造成不利影响[4-5]。对这2种癌症机制的研究，有助于发现新的肿瘤标志物和治疗靶点，为肝癌和子宫颈癌的诊断和治疗提供新方法。毗邻锌指结构域的溴结构域蛋白1A（bromodomain adjacent to zinc finger domain 1A，BAZ1A）又叫做Acf1[6]。BAZ1A在神经发育、精子发生和细胞衰老中都发挥作用[7-9]。本研究发现，BAZ1A在肝癌和子宫颈癌中都高表达。并且不论在肝癌还是子宫颈癌中，BAZ1A表达水平较高组的癌症患者预后更差。BAZ1A在肝癌和子宫颈癌中都发挥促癌作用。本研究聚焦BAZ1A在肝癌和子宫颈癌中的共同促癌机制，以更好地理解和认识BAZ1A在癌症发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般材料

人肝癌亚力山大细胞（primary liver carcinoma /poliomyelitis research foundation / 5，PLC/PRF/5）和人子宫颈癌海拉细胞（henrietta lacks，Hela）均购买于天津塞尔有限公司[细胞已经过短串联重复序列（short tandem repeats，STR）验证]；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购买于安徽康源生物技术有限责任公司（货号：KY-01002）；1%青霉素-链霉素、杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）培养基、0.25%胰蛋白酶均购买于美国Gibco公司（货号：15140122、C11995500BT、25200056）；35 mm细胞培养皿、90 mm细胞培养皿均购买于美国康宁公司；1×PBS购买于北京索莱宝科技有限公司（货号：P1020）；siRNA购买于苏州吉玛基因股份有限公司（si-BAZ1A：5’-UGUUGCCUAGACCUUCAUCTT-3’，si-NC：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

取出冻存的细胞于37 ℃水浴锅中轻轻晃动使其快速解冻，弃掉细胞悬液上清，加入新鲜的全培养基（含10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基）重悬，将细胞悬液转移至35 mm细胞培养皿中，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养12～24 h，中间可对其进行换液。当细胞密度达到80%～90%时，即可进行细胞传代。PBS清洗2遍，加入胰酶对细胞进行消化，后加入1 mL全培养基终止消化。将细胞悬液离心800 r/min，5 min。弃上清，加入1 mL全培养基混匀细胞，将细胞悬液以1∶2或1∶3的比例传至90 mm细胞培养皿中进行扩大培养，细胞培养箱中培养24 h左右，传代3次以上即可进行后续实验。

1.2.2 转录组测序

实验设置实验组和对照组，转染si-BAZ1A至肝癌PLC/PRF/5细胞和子宫颈癌Hela细胞为实验组，转染NC-siRNA至肝癌PLC/PRF/5细胞和子宫颈癌Hela细胞为对照组，4组细胞分别进行转录组测序。使用Trizol试剂从细胞样本提取各组总RNA，送往上海中科新生命公司完成转录组测序。首先对抽提的RNA进行质检，样本检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠从1 μg的总RNA中纯化mRNA。随后加入fragmentation buffer将mRNA进行随机打断。以mRNA片段为模板，用随机引物和逆转录酶合成cDNA第一链，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶Ⅰ合成cDNA第二链，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）富集得到最终的cDNA文库。检测文库的插入片段长度和有效浓度，最后按照不同文库目标测序数据量不同，上机进行测序。

1.3 观察指标

肝癌组DEGs、子宫颈癌组DEGs、共有DEGs的获取；肝癌组DEGs、子宫颈癌组DEGs、共有DEGs的基因本体论（gene ontology，GO）富集分析结果；肝癌组DEGs、子宫颈癌组DEGs、共有DEGs的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析结果；肝癌组DEGs、子宫颈癌组DEGs、共有DEGs的蛋白质互作（protein-protein interaction，PPI）分析结果。

1.4 数据分析

1.4.1 获得DEGs

将样品通过RNA测序后应用R4.2.1软件分析，采用“DESeq2”包对肝癌实验组测序结果和肝癌对照组测序结果进行差异分析，筛选出肝癌组DEGs，对子宫颈癌实验组测序结果和子宫颈癌对照组测序结果进行差异分析，获得子宫颈癌组DEGs。应用“ggplot2[3.3.6]，VennDiagram[1.7.3]”包筛选BAZ1A在肝癌和子宫颈癌里的共有DEGs并绘制韦恩图。

1.4.2 GO和KEGG富集分析

应用R（4.2.1）“clusterProfiler [4.4.4]”包分别对肝癌组DEGs、子宫颈癌组DEGs、共有组DEGs进行GO和KEGG富集分析。应用“ggplot2 [3.3.6]”包根据分析结果绘制柱状图和气泡图。

1.4.3 蛋白互作网络分析

将肝癌组294个DEGs、子宫颈癌组DEGs前2 000个（筛选标准：P＜0.05，log2fold change绝对值＞1）、共有组170个DEGs导入STRING数据库（https://cn.string-db.org/）获取DEGs的高等置信度（＞0.900）的蛋白-蛋白对，隐藏网络中断开连接的节点，基于上述蛋白-蛋白对构建蛋白互作网络关系图。并使用Cytoscape（3.9.1）软件根据Degree值寻找各组DEGs中的核心基因。

2 结果

2.1 KEGG富集分析结果

将肝癌组DEGs和子宫颈癌组DEGs分别进行KEGG通路富集（P＜0.1），在2种癌症里都显著富集的KEGG通路包括细胞外基质-受体相互作用、焦点黏附、小细胞肺癌、人乳头状瘤病毒感染、病毒性致癌这些通路（图1A，图1B）。肝癌组共获得294个DEGs、子宫颈癌组共获得5 662个DEGs。对肝癌组DEGs和子宫颈癌组DEGs进行Venn分析，筛选出170个共有DEGs（图1C）。对共有DEGs进行KEGG富集分析，共涉及9条通路：细胞外基质-受体相互作用、焦点黏附、癌症中的转录失调、小细胞肺癌、病毒性致癌、中性粒细胞胞外陷阱的形成、系统性红斑狼疮、造血细胞谱系、酗酒（图1D）。

图1 DEGs的韦恩图和KEGG富集分析气泡图

2.2 GO富集分析结果

将肝癌组DEGs、子宫颈癌组DEGs富集到P＜0.05的GO功能条目取交集，对共有的GO条目按每一条目中包含的差异基因数量降序排列，取前50个条目，在生物过程（biological process，BP）类别下按照癌症的特征主要富集到发育和生长过程、BP调节、化学反应和信号传导、细胞运动和定位、免疫系统过程。每类各取3项展示，不足3项的展示实际数目。（图2A）。共有DEGs在BP条目中富集到的结果涉及多生物繁殖过程、核小体组装、多细胞BP等；细胞组成（cellular component，CC）条目富集结果主要涉及蛋白质DNA复合物、DNA包装复合物、整合素复合体等；分子功能（molecular function，MF）主要涉及酶抑制剂活性、蛋白质异二聚化活性、激酶调节剂活性等（图2B）。

图2 各组DEGs的GO富集分析结果

2.3 差异基因蛋白互作网络分析

将肝癌组DEGs、共有DEGs以及筛选出的前2 000个子宫颈癌组DEGs导入STRING数据库中，从肝癌组生成的PPI网络图中筛选出2个核心基因：H4簇状组蛋白5（H4 clustered histone 5，H4C5）、H4簇状组蛋白14（H4 clustered histone 14，H4C14）；从子宫颈癌组生成的PPI网络图中筛选出3个核心基因：激太原1（kininogen 1，KNG1）、圆盘大MAGUK支架蛋白4（discs large MAGUK scaffold protein 4，DLG4）、分化簇44（cluster of differentiation，CD44）；从共有组生成的PPI网络图中筛选出1个核心基因：H2A簇状组蛋白18（H2A clustered histone 18，H2AC18）。把筛选出的核心基因和与其相互作用的DEGs，再次导入Cytoscape软件，生成核心基因及其相互作用基因的PPI网络图。见图3。

图3 各组核心基因及其相互作用基因的PPI网络分析结果

3 讨论

目前BAZ1A的研究方向主要集中在神经发育、精子发生和细胞衰老中，也有研究表明其与抑郁易感性有关，并调节应激相关行为[10]。BAZ1A的失调可导致各种疾病的发生，特别是癌症。在乳腺癌、肺癌和白血病中发现BAZ1A高表达，并且这种高表达与不良的总生存期相关[9-11]。这表明BAZ1A在癌症方面可能发挥着重要作用。

在本研究中，肝癌组DEGs、子宫颈癌组DEGs和共有DEGs都富集到的KEGG通路包括细胞外基质-受体相互作用通路和焦点黏附通路。细胞和细胞外基质之间的特异性相互作用主要由整合素这种跨膜分子介导。整合素是主要的细胞黏附跨膜受体，作为细胞外基质-细胞骨架连接体和转换器，在细胞与其环境之间的信号传递中发挥着多方面的作用。除此之外，许多肿瘤研究发现整合素在肿瘤细胞迁移、黏附等生物学功能中发挥着重要作用[12-13]。焦点黏附位于上皮基底表面，由整合素、钙蛋白、肌动蛋白等多个蛋白质组成。焦点黏附可以将周围的细胞外基质与肌动蛋白细胞骨架整合在一起，是细胞与细胞外部基质之间的一个重要连接点[14]。焦点黏附的形成和稳定对于细胞增殖、迁移、分化、凋亡等过程都具有重要作用[14-16]。另外，肝癌组DEGs和子宫颈癌组DEGs都显著富集的GO条目包括细胞运动、细胞黏附。本课题组之前的研究也表明，在肝癌和子宫颈癌细胞中敲低BAZ1A表达，肝癌细胞和子宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力减弱和凋亡水平升高。

本研究对肝癌组、子宫颈癌组以及共有DEGs进行了PPI网络分析，其中，在DEGs中处于核心位置的CD44是上皮细胞间充质转化的关键调节因子，是一种分布广泛的细胞表面跨膜糖蛋白。CD44参与了多种细胞功能，包括增殖、迁移、侵袭和代谢等[17-18]。CD44可以黏附在细胞外基质上，通过其胞外结构域与透明质酸和胶原蛋白结合，在肿瘤细胞的转移中起到重要作用[19]。另外，CD44通过调节内皮细胞的增殖、迁移、黏附等多种功能，促进病理性血管生成及其相关疾病的发展[20]。

综上所述，在本研究中通过转录组测序及生物信息学分析，得出BAZ1A能够通过细胞外基质-受体相互作用、焦点黏附等通路调控肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡，为阐明肝癌和子宫颈癌的发病机制提供了新的思路。