紫龙金联合埃克替尼对Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能及肿瘤血管生成的影响

李 朕 张洪亮 严胜利 陈月婵 邬 超 蔡 钢

(1 新疆医科大学第四临床医学院,乌鲁木齐,830000; 2 石河子大学第一附属医院,石河子,832000; 3 新疆医科大学附属中医医院肿瘤二科,乌鲁木齐,830000; 4 新疆维吾尔自治区人民医院呼吸与危重医学科,乌鲁木齐,830000)

肺癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,最新的流行病学数据显示,2020年全球范围内新发肺癌221万例,因肺癌死亡180万例[1-2]。肺癌的发病率和死亡率呈现持续上升趋势,而血管生成在肿瘤的生长和转移过程中起重要作用。抑制肿瘤血管生成可限制肿瘤细胞获取氧气和营养物质,并阻断其侵袭和转移所需的通路,成为治疗肺癌的重要策略之一[2]。紫龙金是一种传统中药,由黄芪、当归、白英、龙葵、丹参、半枝莲、蛇莓、郁金组成,其活性成分具有抗肿瘤和抗血管生成的特性[3]。此外,既往研究还发现紫龙金片对肝癌、肺癌小鼠模型有抗癌作用,其主要通过激活人体淋巴细胞,促进T淋巴细胞增殖,提高巨噬细胞的吞噬能力,从而有效增强机体免疫能力[3]。埃克替尼是一种靶向治疗药物,主要针对表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR),可用于肺癌的治疗,被广泛应用于临床,并取得了良好疗效[4]。然而,紫龙金和埃克替尼在肺癌血管生成和免疫功能方面的相互作用尚未明确。本研究探究紫龙金和埃克替尼对Lewis肺癌荷瘤小鼠模型中肿瘤血管生长的抑制作用,并评估其对细胞免疫功能的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物、细胞 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级C57BL/6雄性小鼠50只,4～6周龄,体质量18～22 g,购于上海西普尔必凯实验动物有限公司,生产许可证号:SCXK(沪)2020-0016。将所有小鼠饲养在无菌的鼠房中,恒温25 ℃,每12 h进行1次昼夜交替,给予充足的粮食和水。小鼠Lewis肺癌细胞株(上海冠导生物工程有限公司,批号:GD-C9819889),采用高糖的含10%胎牛血清的改良Eagle培养基(Dulbeccos Modification of Eagles Medium,DMEM)培养基进行培养,培养环境为37 ℃,5%CO2培养箱。动物实验经我院实验动物动心实验动物伦理委员会批准(伦理审批号:A2023-069-01)。

1.1.2 药品 紫龙金片(天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂,包装规格:0.65 g,国药准字Z20010064);埃克替尼(贝达药业股份有限公司,125 mg/片,国药准字H20110061)。

1.1.3 试剂与仪器 DMEM培养基(CHI Scientific公司,美国,批号:3-2010);胰酶(北京伊塔生物科技有限公司,批号:YT00044);无菌生理盐水(上海抚生实业有限公司,批号:FS-P0178);FITC anti-mouse CD3 Antibody(BioLegend公司,美国,批号:100203);APC anti-mouse CD4 Antibody(BioLegend公司,美国,批号:100515);PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8b.2 Antibody(BioLegend公司,美国,批号:140417);PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody(BioLegend公司,美国,批号:103235);放射性免疫沉淀分析(Radioimmunoprecipitation Assay,RIPA)裂解液(上海羽朵生物科技有限公司,批号:LG-PS0013);10%体积的10 mmol/L PMSF(MyBioSource公司,美国,批号:MBS355475-E);白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)试剂盒(EK-Bioscience公司,批号:EK-M25951);肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)ELISA试剂盒(EK-Bioscience公司,批号:EK-M29261);γ干扰素(Interferon Gamma,IFN-γ)ELISA试剂盒(EK-Bioscience公司,批号:EK-M25913);血管内皮生长因子ELISA试剂盒(EK-Bioscience公司,批号:EK-M29117);二氧化碳(Carbon Dioxide,CO2)培养箱(Eppendorf公司,美国,批号:S41I230014);酶标仪(BioTek公司,美国,型号:BioTek Synergy H1);流式细胞仪(BD Biosciences公司,美国,型号:Accuri C6);离心机(青岛澳柯玛生物医疗有限公司,型号:ALX-18R);4 ℃冰箱(海尔公司,型号:HXC-149)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 参考既往文献[5-6]构建Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。从液氮中取出Lewis肺癌细胞株于37 ℃恒温水浴中使其完全解冻,将恢复活力的Lewis肺癌细胞株悬浮于DMEM培养基,并在37 ℃的CO2培养箱中进行培养,待细胞进入对数生长期,使用胰酶消化细胞,并制备5×106个/mL的细胞悬液备用。取10只小鼠,在无菌条件下将细胞悬液(0.2 mL/只)注射到小鼠的右前肢腋窝皮下,建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型。在无菌条件下饲养14 d后脱颈椎处死小鼠,将瘤体组织剥离、剪碎、匀浆,制备成1×107个/mL的Lewis瘤细胞悬液。取40只小鼠,于右前肢腋窝皮下分别接种0.2 mL的Lewis瘤细胞悬液。模型制备成功标准:7 d后,在接种部位触摸到约黄豆大小的结节状肿块[6]。将造模成功的40只小鼠随机分为模型组、紫龙金组、埃克替尼组、联合观察组,每组10只。

1.2.2 给药方法 参照相关文献[7],紫龙金组将紫龙金片碾碎后溶于无菌生理盐水备用,每只小鼠采用灌胃的方式给予紫龙金水溶剂,给药剂量为20 g/kg;埃克替尼组灌胃给予埃克替尼,给药剂量5 mg/kg[8];联合观察组给予紫龙金与埃克替尼联合治疗,给药方法同紫龙金组、埃克替尼组。模型组给予同紫龙金组相同剂量的生理盐水灌胃。4组均每日给药2次,间隔12 h,持续14 d,末次给药后小鼠禁食24 h,取眼眶静脉血。随后处死小鼠,收集小鼠的肿瘤组织保存备测。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 肿瘤生长抑制率检测 处死小鼠后,取小鼠接种部位肿瘤称重,计算肿瘤生长抑制率。肿瘤生长抑制率=(模型组平均肿瘤重量-观察组平均肿瘤重量)/模型组平均肿瘤重量×100%[6,9]。

1.2.3.2 血管生长指标检测 1)血管内皮生长因子的检测:参照先前文献[10-11]的方法进行评估分析,对小鼠进行静脉取血后,将收集的血液进行离心3 min,离心半径7 cm,离心转速为12 000 r/min,之后收集上清液,按照说明,用ELISA试剂盒检测小鼠血管内皮生长因子水平。2)微血管密度(Microvessel Density,MVD)检测:参照先前文献[12]里的方法来评估肿瘤MVD。具体而言,将肿瘤血管组织进行石蜡包埋并切成4 μm厚的切片,把切片放入二甲苯中2次脱蜡,10 min/次。然后把切片放入无水乙醇中10 min洗去二甲苯。之后,把切片依次放入95%、90%、80%和70%乙醇中各1次,2 min/次。进行切片抗原修复,即将切片放入盛有枸橡酸盐缓冲液(工作液)的容器中,置微波炉内加热使温度保持在92～98 ℃之间并持续10～15 min。取出容器,室温冷却10～20 min。之后,用PBS冲洗,5 min×3次。使用1%BSA封闭液封闭非特异性结合位点,滴加CD34一抗进行4 ℃孵育过夜,次日将切片与对应的二抗继续进行孵育,并使用DAB进行核复染,最后在显微镜下观察。将染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇视为1个计数单位,而不计数血管腔大于8个红细胞大小且具有较厚肌层的血管。首先在低倍视野下选取5个MVD较高的区域,通过观察CD34阳性细胞(染成棕色的内皮细胞)来确定最高的血管密度区域。高倍镜下(×200)将孤立的内皮细胞或细胞簇视为1个计数单位,记录5个视野内的微血管数量,取平均值。计数标准:单个染色阳性的血管内皮细胞;1个染色阳性的血管内皮细胞簇;血管干上的分支结构。

1.2.3.3 脾脏免疫细胞检测 处死小鼠后,在无菌条件下分离小鼠脾脏,制备脾细胞悬液。加入红细胞裂解液裂解红细胞,在冰浴中孵育30 min后离心去除上清液,并用磷酸缓冲盐溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)进行洗涤,将细胞调整至107个/mL。取100 μL细胞悬液,加入2 μL的异硫氰酸荧光素(Fluorescein Isothiocyanate,FITC)anti-mouse CD3 Antibody、1 μL的anti-mouse CD4 Antibody、1 μL的PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8b.2 Antibody、1 μL的PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody。4 ℃避光条件下孵育40 min,用PBS进行洗涤,并去除上清液,用流式细胞仪检测小鼠脾脏细胞内CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞的比例。

1.2.3.4 肿瘤组织炎症介质检测 采集小鼠肿瘤组织后,取适量肿瘤组织制备匀浆,用90%体积RIPA裂解液和10%体积的10 mmol/L PMSF进行组织匀浆(10%),置于冰上裂解30 min,于12 000 r/min离心30 min,离心半径为7 cm,取上清液,置于4 ℃冰箱保存备测。分别用对应的ELISA试剂盒检测肿瘤组织IL-2、TNF-α、IFN-γ。

2 结果

2.1 紫龙金及埃克替尼对小鼠肿瘤生长的抑制作用 与模型组比较,紫龙金组、埃克替尼组、联合观察组小鼠肿瘤重量低(均P<0.05);与紫龙金组及埃克替尼组比较,联合观察组小鼠肿瘤重量低(均P<0.05),肿瘤生长抑制率高(P<0.05)。紫龙金组与埃克替尼组小鼠肿瘤重量、肿瘤生长抑制率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肿瘤重量及肿瘤生长抑制率比较

2.2 各组小鼠血管内皮生长因子水平比较 模型组、紫龙金组、埃克替尼组、联合观察组小鼠血管内皮生长因子水平分别为(129.10±21.87)、(85.70±6.36)、(81.10±9.15)、(69.70±5.29)pg/mL。与模型组比较,紫龙金组、埃克替尼组、联合观察组小鼠血管内皮生长因子水平低(均P<0.05);与紫龙金组及埃克替尼组比较,联合观察组小鼠血管内皮生长因子水平低(均P<0.05);紫龙金组与埃克替尼组小鼠血管内皮生长因子水平比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。

2.3 各组小鼠MVD比较 免疫组化染色结果揭示各组小鼠MVD的组织表达情况。见图1。模型组、紫龙金组、埃克替尼组、联合观察组小鼠MVD分别为(1.39±0.21)%、(0.63±0.05)%、(0.65±0.05)%、(0.42±0.08)%。与模型组比较,紫龙金组、埃克替尼组、联合观察组小鼠MVD低(均P<0.05)。与紫龙金组及埃克替尼组比较,联合观察组小鼠MVD低(均P<0.05);紫龙金组与埃克替尼组小鼠MVD比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。

图1 免疫组化染色检测各组小鼠MVD组织表达水平

2.4 各组小鼠血清免疫细胞比例比较 与模型组比较,紫龙金组、埃克替尼组、联合观察组小鼠血清CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞的百分比例均高于模型组(均P<0.05);与紫龙金组及埃克替尼组比较,联合观察组小鼠血清CD4+T淋巴细胞比例、CD8+T淋巴细胞比例、B淋巴细胞比例较高(均P<0.05);紫龙金组与埃克替尼组小鼠血清的CD4+T淋巴细胞比例、CD8+T淋巴细胞比例、B淋巴细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组小鼠血清免疫细胞比例比较

2.5 各组小鼠肿瘤组织炎症介质水平比较 与模型组比较,紫龙金组、埃克替尼组、联合观察组小鼠肿瘤组织IL-2、TNF-α、IFN-γ水平低(均P<0.05);与紫龙金组及埃克替尼组比较,联合观察组小鼠肿瘤组织IL-2、TNF-α、IFN-γ水平低(均P<0.05);紫龙金组与埃克替尼组小鼠肿瘤组织IL-2、TNF-α、IFN-γ水平比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表3。

表3 各组小鼠肿瘤组织炎症介质水平比较

3 讨论

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因[2,13-14],肺癌的治疗策略包括手术切除、放疗、化疗和靶向治疗等[14]。手术切除是早期肺癌的主要治疗方法,但对于晚期肺癌或存在远处转移的患者来说,手术切除的效果有限[15]。放疗和化疗可以控制肿瘤生长和转移,但常伴有严重的不良反应[15]。近年来,靶向治疗作为一种个体化的治疗策略,在肺癌治疗中取得了显著疗效[16-17]。针对EGFR突变的患者,埃克替尼等EGFR酪氨酸激酶抑制剂已经成为标准的一线治疗方案[17]。然而,由于肿瘤的异质性和耐药性的出现,单一靶向治疗的效果通常不持久。

既往研究表明,紫龙金作为传统中药,有多种生物活性成分(黄酮类、多糖类和三萜类化合物等),具有抗肿瘤、抗氧化和抗炎等多种作用[18]。本研究结果显示,紫龙金与埃克替尼联合治疗后小鼠的肿瘤重量和小鼠肿瘤生长抑制率高于二者单独治疗,这一发现说明紫龙金与埃克替尼联合使用具有更强的抗肿瘤作用,能够在一定程度上提高治疗效果。

血管内皮生长因子是一种关键的血管生成因子,能够促进内皮细胞的增殖、迁移和血管通透性增加,从而在肿瘤血管生成中发挥核心作用[19]。MVD则反映了肿瘤组织内新生血管的数量和密度,是评估肿瘤血管生成程度的重要指标。MVD的增加通常意味着肿瘤血管生成活跃,肿瘤细胞的供血和营养供应充足,从而加速了肿瘤的生长和转移[20]。埃克替尼作为靶向治疗药物,可以抑制EGFR活性,进而抑制肿瘤细胞的生长和分裂[21-22]。紫龙金与埃克替尼联合治疗抑制Lewis肺癌小鼠血管生成的机制可能与二者共同抑制血管内皮生长因子表达有关。本研究结果显示,紫龙金与埃克替尼联合治疗后小鼠血管内皮生长因子水平降低。本研究发现,紫龙金与埃克替尼联合治疗后肿瘤内MVD降低,说明二者降低了肿瘤的供血和营养,从而限制了肿瘤的生长和扩散。

CD4+T淋巴细胞,又称辅助性T细胞,在免疫应答中起到调控和协调的作用。它们能够激活其他免疫细胞,如CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞,从而发起针对肿瘤细胞的特异性免疫反应。CD4+T淋巴细胞的增加通常意味着机体免疫功能的增强,有助于更有效地抵抗肿瘤[23]。CD8+T淋巴细胞,即细胞毒性T细胞,是机体抗肿瘤免疫的主要效应细胞。它们能够直接识别并杀灭肿瘤细胞,是机体对抗肿瘤的重要细胞。CD8+T淋巴细胞数量的增加和活性的提高,有助于增强机体对肿瘤细胞的清除能力[23]。紫龙金作为传统中药,已知具有抗炎和抗氧化作用,能够激活淋巴细胞,增强免疫反应。已有研究表明,紫龙金能够调节免疫细胞的功能和数量,从而增强机体的抗肿瘤能力。埃克替尼作为靶向治疗药物,虽然主要针对肿瘤细胞的特定分子靶点,但其对免疫系统的影响也不容忽视。一些研究表明,靶向治疗药物可能通过调节免疫微环境,增强机体的免疫反应,从而提高治疗效果[24-25]。本研究结果显示,紫龙金与埃克替尼联合治疗后小鼠免疫细胞比例升高。紫龙金和埃克替尼协同作用增加淋巴细胞活性,激活免疫系统,使其更有效地抵抗肿瘤细胞。

IL-2是一种重要的免疫调节因子,能够促进T淋巴细胞的增殖和分化,增强机体的细胞免疫应答。在抗肿瘤免疫中,IL-2能够激活和增强CD4+T细胞和CD8+T细胞的活性,从而增强机体对肿瘤细胞的识别和清除能力[26]。TNF-α则是一种具有广泛生物活性的细胞因子,能够诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的生长和转移。同时,TNF-α也能够激活其他免疫细胞,如巨噬细胞,进一步增强机体的抗肿瘤免疫反应[26]。本研究结果显示,紫龙金与埃克替尼联合治疗后肿瘤组织IL-2、TNF-α、IFN-γ水平下降。IFN-γ作为一种免疫调节因子,可抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,下调血管内皮生长因子的表达,从而抑制肿瘤血管的形成。检测IFN-γ的水平可以间接反映肿瘤的生长状况。此外,在口咽癌的研究中显示,紫龙金通过干预受体和通路活性以及调控TNF-α等信号通路发挥抗癌作用[27];而埃克替尼被证明在非小细胞肺癌的发生发展中具有良好的抗肿瘤作用,但具体作用靶点尚未揭示[28]。本研究的结果表明紫龙金与埃克替尼的联合使用在抑制肿瘤生长的同时,也影响了肿瘤组织内的免疫微环境,减少了炎症介质的释放。

综上所述,本研究采用Lewis肺癌荷瘤小鼠构建模型,发现紫龙金与埃克替尼联合治疗可抑制肿瘤生长及血管生成,增强免疫功能,减轻炎症反应。本研究为肺癌治疗策略制定提供重要的理论和实验基础。然而,本研究仍存在一些不足之处,需要在后续研究中加以改进和完善。首先,本研究仅在小鼠模型上进行了初步探索,虽然取得了一定的研究成果,但尚需进一步在人体上进行临床试验,以验证紫龙金与埃克替尼联合治疗的疗效和安全性。其次,本研究对于紫龙金与埃克替尼联合治疗的具体机制仍需要深入研究,以便更好地优化治疗方案,提高治疗效果。此外,本研究未涉及紫龙金与埃克替尼联合治疗的最佳用药剂量和用药时间等问题,这也是后续研究需要关注的重要方向。

利益冲突声明:无。