不同时期独活不同部位中香豆素类成分积累规律研究

尹转霖 姬党通 李 欠

(1 甘肃农业大学农学院,兰州,730070; 2 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室,兰州,730070)

独活(RadixAngelicaePubescentis)为伞形科(Umbelliferae)当归属(AngelicaL.)植物重齿毛当归(AngelicapubescenMaxinf.biserrataShan et Yuan)的干燥根[1],主产于四川、湖北、安徽等地。独活味辛、苦,微温,归肝、肾、膀胱经,其祛风胜湿、散寒止痛,主要用于治疗风寒湿痹、腰膝疼痛、少阴伏风头痛、头痛齿痛等症[2]。独活始载于《神农本草经》,被列为上品,自古以来为治疗风湿痹痛的要药[3]。

独活中主含有香豆素和挥发油类成分,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗老年痴呆等药理作用[4-7],还含有甾醇、有机酸、糖类等成分[8-9]。据国内外研究报道,发现从独活中分离得到的94个化合物中,香豆素类化合物69个,其他类化合物25个[10-13]。香豆素类化合物是独活中的主要活性成分,其含量的高低是衡量独活药用价值和质量品质的重要指标,因其具有共轭双键结构而表现出抗炎、抗凝血、抗癌、镇静、抗焦虑、抗癫痫等药理作用[14-18]。

气相色谱-质谱(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)作为一种分离检测化合物的新方法,将色谱的分离能力和质谱的鉴定能力结合起来,能够准确地对待测成分进行定性、定量分析,因其高灵敏度和准确度等特性,使用范围广泛。GC-MS联用在中药领域主要应用于挥发性成分的分析测定中[19-23]。

本研究将GC-MS技术应用到独活香豆素类成分的鉴别分析中,通过对不同时期独活根、茎、叶中的主效成分进行研究,观察不同时期、不同部位独活中香豆素类成分含量的动态变化规律,以期建立采用GC-MS分析独活中香豆素类成分的方法,本研究为独活药材的质量控制及高效利用提供一定的科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 三重四极杆气相色谱质谱联用仪(安捷伦公司,美国,型号:Agilent 7890B-7000D),电热恒温真空干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司,型号:DZF-1B),万分之一天平(上海力辰邦西仪器科技有限公司,型号:AL104),小型高速粉碎机(山东精诚医药装备制造有限公司,型号:WK-1000),电子天平(慈溪市天东衡器厂,型号:HX203T),超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司,型号:SB25-12DTD)。

1.2 试剂 甲醇(国药集团化学试剂有限公司,批号:20210930)。

1.3 分析样品 独活取自甘肃省华亭市马峡镇赵庄村(106°30′0.03″E,35°14′21.12″N),经甘肃农业大学中草药栽培与鉴定系陈垣教授鉴定并确认为伞形科植物重齿毛当归,实验分别以4月、6月、8月、10月、12月的独活新鲜根、茎、叶作为材料,12月份独活地上部分干枯,茎叶不进行采样。

2 方法与结果

2.1 GC-MS分析条件 气相色谱条件:色谱柱DB-23(30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱温起始温度为35 ℃,保持1 min,以8 ℃/min的速率升至150 ℃,保持1 min,再以4 ℃/min的速率升温至250 ℃,保持12 min;分流比5∶1,流速为1 mL/min,载气为氦气。质谱条件:进样口温度250 ℃,离子源温度为230 ℃,四极杆温度150 ℃;电离方式采用电子轰击离子化(EI源),电子能量为70 eV;选择SIM离子检测模式;扫描范围50～650(m/z)。

按照上述分析条件对独活根、茎、叶醇提取物中的化学成分及各组分的相对质量分数进行确认和测定,得到独活根、茎、叶中化学成分的GC-MS总离子流图。经NIST14.L标准质谱库检索对照,并与相关参考文献佐证,分析确定独活不同部位的化学成分。

按照2项下的方法进行分析,得独活根中香豆素类成分的GC-MS总离子流图。

2.2 样品溶液的制备 将不同时期的独活根、茎、叶于40 ℃条件下进行干燥粉碎,过40目筛,干燥至恒重。分别取不同部位独活干燥后的药材粉末约5 g,精密称定,分别加入甲醇50 mL于锥形瓶中,精密称定总重量,浸泡30 min,在40 ℃条件下于水浴中超声(功率:400 W,频率:40 kHz)提取40 min,取出,冷却至室温,用甲醇补足减失的重量,摇匀滤过,再用0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.3 数据分析 采用GC-MS联用仪对化合物进行全离子扫描,以此得到不同时期、不同部位独活的总离子流图,通过化合物的保留时间和质谱数据,利用NIST质谱库对质谱图进行检索,选择匹配度高于80%的色谱峰,依据现有相关文献对香豆素类化合物进行定性鉴定,同时根据峰面积归一化法来计算各组分的相对含量。

2.4 独活不同部位中化学成分分析 根中化合物种类最多,分析鉴定出了59种化合物,茎中鉴定出了45种化合物,叶中分析鉴定出了44种化合物。见图1,表1。

表1 独活活性成分分析

图1 独活不同部位中化学成分总离子流

2.5 独活不同部位有效成分鉴定分析 由表1可知,超声辅助醇提取的独活中主要活性成分为香豆素类化合物、酯类化合物、烯烃类化合物、醇酚类化合物和脂肪酸类化合物。茎、叶中所含的活性成分的种类基本相同,香豆素类成分作为独活中的活性成分,对其代表性成分花椒毒素、蛇床子素、二氢欧山芹素、二氢欧山芹醇当归酸酯分析发现,独活根、茎、叶中都含有以上4种活性成分。

2.6 不同时期独活根中香豆素类成分分析 不同时期独活根中香豆素类成分分析结果见图2。

图2 独活根中香豆素成分GC-MS离子流

不同时期独活根中4种香豆素类成分的相对含量变化明显,蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯作为药典规定的2种指标性成分,其相对含量最高,二氢欧山芹素和花椒毒素成分的含量相对次之;同一时期的香豆素类成分含量变化中,相对含量波动最大的是蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯,二氢欧山芹素和花椒毒素次之。

不同时期独活根中香豆素类成分先增加后减少,不同生长时期对独活香豆素含量变化具有显著影响。在4月至10月生长期时段内,独活根中香豆素含量随生长期的延后呈上升趋势,10月份香豆素类成分含量达到最大。4月至6月生长期的香豆素含量增幅缓慢,独活营养生长前期地上部分处于快速增长阶段,药材营养物质积累较慢。进入8月至10月后香豆素含量增幅较大,独活地上部分生长趋于缓慢,茎叶趋于枯萎,利于根中营养物质的积累。10月之后香豆素含量变化呈下降趋势,独活地上部分的营养转化结束,根系为了维持生命代谢,损耗了部分干物质,该时期不利于独活药材品质的提高。见图3。

图3 不同时期独活根中香豆素类成分含量变化

2.7 不同时期独活茎中香豆素类成分分析 不同时期独活茎中香豆素类成分分析结果见图4。

图4 独活茎中香豆素成分GC-MS总离子流

不同时期独活茎中香豆素类成分变化呈先增大后减小趋势,4个不同时期的香豆素类成分变化中,6月到8月独活地上部分处于快速生长时期,生长旺盛,4种香豆素类成分含量变化趋势明显,8月份含量达到最大。其中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量变化最显著,二氢欧山芹素和花椒毒素次之;同一时期独活茎的香豆素类成分中,蛇床子素含量最高,其次为二氢欧山芹醇当归酸酯、二氢欧山芹素和花椒毒素。见图5。

图5 不同时期独活茎中香豆素类成分含量变化

2.8 不同时期独活叶中香豆素类成分分析 不同时期独活叶中香豆素类成分分析结果见图6。

图6 独活叶中香豆素成分GC-MS总离子流

不同时期独活叶中香豆素类成分变化趋势先增大后减小,其中二氢欧山芹醇当归酸酯含量变化趋势最显著,其次是二氢欧山芹素、蛇床子素和花椒毒素。6月到8月生长时期之间,独活地上部分进入生长旺盛期,叶片中香豆素类成分的含量也随之增加,8月香豆素类成分含量达到最大。8月到10月生长期内,随气温的下降,独活地上部分生长趋于缓慢,叶片中香豆素类成分含量亦随之降低;同一时期独活叶中香豆素类成分含量最高的是二氢欧山芹素,二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素次之,花椒毒素含量最低。见图7。

图7 不同时期独活叶中香豆素类成分含量变化

蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、花椒毒素、二氢欧山芹素4种活性成分以根中含量最高,叶中最低。蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯根中的含量以10月最高,为31.62%和4.89%,茎中以8月最高,而8月时叶中以二氢欧山芹素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量最高,为0.14%和0.77%,10月茎、叶中4种活性成分含量有所下降。

3 讨论

贺云彪和黄兰芳[24]用GC-MS技术对独活提取物进行了分析测定且成功鉴定出了48种成分,后刘洁丽等[25]利用GC-MS技术对当归不同部位的挥发油进行了研究,魏婧等[26]对荆条不同部位中的挥发油成分做了GC-MS分析,结果均显示不同生长部位的挥发油在化学成分组成上有明显差异,且有些成分是特定部位具有的。艾青青等[27]采用GC-MS分析了康定独活根中的挥发油成分,研究结果显示醇类和酯类成分是康定独活根中主要的挥发油成分。本研究采用GC-MS联用技术对不同时期、不同部位独活中的香豆素类成分进行了分析鉴定,由独活香豆素类成分的色谱图可知,在所建立的GC-MS分析条件下,独活香豆素化合物各色谱峰分离度良好。通过分析不同部位中的主要代表性活性成分蛇床子素、二氢欧山芹醇当归酸酯、花椒毒素、二氢欧山芹素的含量变化趋势,发现不同时期同一化合物在不同部位的含量变化存在差异。4种活性成分以根中含量最高,叶中最低,根中蛇床子素和二氢欧山芹醇当归酸酯的含量以10月最高,茎中以8月最高,而叶中8月时以二氢欧山芹素和二氢欧山芹醇当归酸酯含量最高,10月茎、叶中4种活性成分含量有所下降。由此可知,在8月至以后时期,独活地上部分生长趋于缓慢,所需养分逐渐减少,大量同化物向根中转移。10月之后香豆素含量变化呈下降趋势,根系为了维持生命代谢,损耗了部分干物质。

独活作为临床中治疗风湿痹痛的要药,近些年在治疗高血压、骨质疏松、日常保健等方面都被经常使用,现代相关药理研究指出,独活中的活性成分香豆素类化合物在临床应用中发挥了重要作用,通过分析以上4种代表性活性成分,发现各时期独活不同部位中香豆素含量积累变化明显,阐明了不同时期独活药用部位及非药用部位中活性成分的差异性,为独活不同部位活性成分研究与非药用部位资源的合理利用提供理论依据。此外,药用植物中活性成分多且复杂,对活性成分含量动态积累规律的研究在药材质量把控环节中具有至关重要的作用。本研究还为药用植物活性成分的动态积累变化提供一定的科学依据,不同的生长期引起的有效成分含量变化对独活药理活性的影响,有待进一步研究。

利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。