滋肾通关方对糖尿病大鼠肾损伤的改善作用及其机制

梁国强 蒋春波 王健生

(1 南京中医药大学附属苏州市中医医院,苏州,215009; 2 苏州市吴江区中医医院〔苏州市吴江区第二人民医院〕,苏州,215220)

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是一种以持续性蛋白尿和肾功能逐渐下降为特征的临床综合征,是糖尿病最常见的慢性并发症之一,目前影响了40%以上的糖尿病患者,是全球终末期肾病的主要病因之一。DN的发病机制涉及血流动力学和代谢因素,如慢性高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗和高脂血症导致代谢失衡与DN的发生密切相关,病理学认为肾纤维化是DN进行性加重的重要因素,因此早期预防治疗是现代医学面临的重要科学问题和挑战[1]。

滋肾通关方记载于金元医学著作《兰室秘藏》(李东垣),由黄柏、知母、肉桂组成。前期临床研究发现该方能有效改善老年糖尿病前期患者餐后2小时血糖以及血清胰岛素和脂联素水平,调节血脂等[2];实验研究证实其抑制肾盂肾炎大鼠肾脏Toll样受体和核因子κB的表达,降低炎症介质白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4),IL-6和IL-10的水平[3]。提示滋肾通关方具有改善血糖、抗炎症反应以及抑制肾损伤的潜在作用。转化生长因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)/Smads通路在肾纤维化发展进程中发挥着关键作用,其可通过转导和扩增炎症和纤维化信号促进肾病的进展[4]。本实验通过制备糖尿病大鼠早期肾损伤模型,在观察不同剂量滋肾通关方对其肾组织病理改变、血清生化指标及炎症介质水平的变化基础上,观察其对TGF-β1/Smads通路蛋白表达的影响,确定滋肾通关方对糖尿病大鼠肾损伤的调节作用及其可能的通路,为中医药防治DN提供科学依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 50只雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠,8周龄,体质量180～220 g,购于昭衍(苏州)新药研究中心有限公司,许可证号:SCXK(苏)2018-0006。饲养温度21～24 ℃,湿度55%～65%,在12 h自然光照交替的屏障系统内。动物研究是按照南京中医药大学附属苏州市中医医院机构动物护理和使用委员会批准的方案进行(伦理审批号:2021伦动批062)。

1.1.2 药物 滋肾通关方(黄柏30 g、知母30 g、肉桂2 g)中药饮片均由本院药学部提供(购于苏州市春晖堂饮片厂,批号:210314、210104、210427)。参考前期基础设低剂量(7.0 g生药/kg大鼠),按2倍比例扩大设中剂量、高剂量(14.0 g、28.0 g生药/kg大鼠)[5]。由本院中心实验室专业人员制取低、中和高浓度滋肾通关方水煎液0.7 g生药/L、1.4 g生药/mL和2.8 g生药/mL备用。戊巴比妥钠(Sigma公司,美国,货号:57-33-0)。

1.1.3 试剂与仪器 血糖检测仪(强生医疗器材有限公司,型号:ONE TOUCH UltraEasy)及试纸(批号:4795582),尿蛋白定量(CBB法)试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号:C035-2-1);大鼠肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)、IL-6、IL-1β酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司,货号:BYE20040、BYE20064、BYE20024);苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色试剂盒和BCA蛋白检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号:C0105M和P0012S);TGF-β1抗体、Smad3抗体、Smad7抗体、α-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth Muscle Actin,α-SMA)抗体、波形蛋白(Vimentin)抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)抗体(Abcam,英国,货号:ab215715、ab208182、ab272928、ab7817、ab92547、ab9485);全自动生化分析仪(日立,日本,型号:7600),低温冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司,型号:TG-16M);酶标仪(雷勃,芬兰,型号:MK3);显微镜(Olympus,日本,型号:CX23)等。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 50只SD大鼠经适应性饲养1周后,将其随机分为5组(每组10只):对照组、模型组和滋肾通关方低剂量、中剂量、高剂量(ZSTGF-L、ZSTGF-M、ZSTGF-H)组。模型组和ZSTGF-L、ZSTGF-M、ZSTGF-H组采用在高脂高糖饮食4周后,腹腔一次性注射STZ溶液,注射体积10 mL/kg,注射剂量35 mg/kg。参考文献模型制备72 h后尾静脉取血测定血糖(血糖试纸测定),当空腹血糖(Fasting Blood Glucose,FBG)>13.9 mmol/L或随机血糖>16.7 mmol/L,即为糖尿病大鼠模型制备成功,7 d后检测24 h尿蛋白定量(CCB法),当浓度>20 mg/24 h,即为糖尿病肾损伤模型大鼠构建成功[6]。经检测各造模大鼠均符合要求。

1.2.2 干预方法 模型制备成功后,ZSTGF-L、ZSTGF-M和ZSTGF-H组大鼠每天分别灌胃滋肾通关方水煎液7.0 g生药/kg、14.0 g生药/kg和28.0 g生药/kg,对照组和模型组的大鼠灌胃等量生理盐水。每天灌胃1次,连续4周,每周检测各组FBG 1次。末次给药后停止食物供给,于24 h后以戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉取血,放入10 mL离心管中,静置2 h后分离血清后备用。然后立即安乐处死大鼠,取左肾组织用于4%多聚甲醛溶液固定,右肾组织置液氮速冻,于-80 ℃保存备用。

1.2.3 检测指标与方法 HE染色检测肾组织病理改变,将收集的肾组织用4%多聚甲醛固定,然后用梯度乙醇脱水,用二甲苯去除梯度乙醇,最后用石蜡包埋切片(尺寸:50 μm)、染色,在生物光镜下观察肾脏组织损伤和形态紊乱病变。采用全自动生化分析仪测定大鼠血清肾功能指标血尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)、肌酐(Creatinine,Cr)、总胆固醇(Total Cholesterol,TC)、三酰甘油(Triacylglycerol,TG)水平;同步采用酶联免疫吸附试验测定血清肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)。蛋白质印迹法检测肾组织相关蛋白表达水平,将肾组织放入蛋白酶抑制剂PMSF的裂解缓冲液中裂解,4 ℃,13 000 r/min离心15 min,离心半径10 cm。然后用BCA蛋白检测试剂盒测定上清液中的蛋白浓度。蛋白裂解液与样品蛋白分离缓冲液混合,95 ℃变性5 min,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分离20 μg蛋白,转移到聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上。用5%脱脂牛奶在室温下封膜2 h,然后用特异性一抗在4 ℃下孵育过夜。最后,将膜和相应的二抗在室温下孵育2 h,增强化学发光、曝光显影后,利用ImageJ软件对蛋白条带的灰度值进行分析。

2 结果

2.1 各组大鼠FBG的比较 与对照组比较,模型组FBG水平明显升高(P<0.05),4次(1次/周)检测到FBG水平均高于16.7 mmol/L,均值达到23.0 mmol/L。滋肾通关方不同剂量干预后,大鼠FBG水平均有不同程度下降。在第4周时,ZSTGF-L、M和H组FBG浓度均值分别为19.0 mmol/L、18.0 mmol/L和15.0 mmol/L,与模型组比较,滋肾通关方各组大鼠FBG水平明显降低(均P<0.05)。见图1。

图1 滋肾通关方(ZSTGF)对糖尿病肾损伤大鼠FBG水平的影响

2.2 病理学观察肾组织病理变化 对照组大鼠的肾组织HE染色未见病理改变,而模型组大鼠肾组织损伤明显,表现为肾小管上皮细胞脱离水肿,肾小球系膜细胞增殖,肾小球基底膜扩张,肾小管扩张萎缩,局灶性炎症细胞浸润和纤维增生,糖原丰富。滋肾通关方治疗可减轻上述损伤,其中滋肾通关方中剂量、高剂量组对DN大鼠的肾组织保护作用显著。滋肾通关方可改善DN大鼠的肾损伤,且随着剂量的增加,作用更为显著。见图2。

图2 滋肾通关方(ZSTGF)对糖尿病肾损伤大鼠肾组织病理学改变的影响(HE染色,×400)

2.3 对糖尿病大鼠肾功能损伤的影响 与对照组比较,模型组BUN、Cr、TC和TG水平均显著升高(均P<0.05)。与模型组比较,滋肾通关方低剂量、中剂量、高剂量组大鼠血清的BUN、Cr、TC、TG水平均显著降低(P<0.05),且随剂量增加下降更显著。提示滋肾通关方可明显改善糖尿病大鼠肾功能损害。见图3。

图3 滋肾通关方(ZSTGF)对糖尿病肾损伤大鼠肾功能的影响

2.4 各组大鼠血清炎症介质水平比较 与对照组比较,模型组的大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高(均P<0.05)。与模型组比较,滋肾通关方低剂量、中剂量、高剂量组的大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著降低(均P<0.05),且随其剂量的增加下降更明显。见图4。

图4 滋肾通关方(ZSTGF)对糖尿病肾损伤大鼠血清炎症介质水平的影响

2.5 各组肾脏TGF-β1/Smads信号通路蛋白表达比较 与对照组比较,模型组TGF-β1、Smad3、α-SMA、波形蛋白表达水平显著升高,Smad7蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。滋肾通关方低剂量组与模型组比较,蛋白表达水平TGF-β1和α-SMA具有下调趋势且Smad3和波形蛋白显著下调(均P<0.05),而Smad7显著升高(P<0.05)。滋肾通关方中剂量、高剂量组与模型组比较,TGF-β1、Smad3、α-SMA、波形蛋白表达水平显著下调(均P<0.05),Smad7蛋白表达水平显著上调(P<0.05),且呈一定的浓度依赖性。见图5。

图5 滋肾通关方(ZSTGF)对糖尿病肾损伤大鼠肾脏TGF-β1/Smads通路表达的影响

3 讨论

中医药在防治肾纤维化方面积累了丰富的经验,肾纤维化信号通路研究也成为筛选和研究中药作用机制和靶点手段[7]。中医药对DN防治的疗效确切,研究表明,中医药能干预糖尿病肾损伤的炎症反应[8],通过抑制肾小管上皮细胞的焦亡、间充质转化等多种作用机制发挥治疗作用[9]。

基于“滋阴清热”立论的滋肾通关方以黄柏、知母等量配伍,少佐肉桂。黄柏清热燥湿,泻火除蒸为君,知母清热泻火,滋阴润燥为臣,二者相须为用,有补水泻火、滋阴清热之功,主治阴虚内热、骨蒸盗汗,是典型的治疗消渴的药对;肉桂补火助阳,引火归元,散寒止痛,温通经脉为佐药,既能温补肾阳、行气利水,又有缓和知母黄柏甘寒苦寒之效,三者共奏“滋补阴液、清利内热”标本兼治之功效,又无甘寒苦寒伤脾胃之弊。临床上近代名医施今墨以药对形式将其应用于糖尿病之“下消”,证见小便混浊、如膏如脂者[10],临床观察发现以该方为主联合西药口服显著降低早期DN患者24 h尿蛋白定量、尿微量白蛋白,并提高血浆白蛋白水平,总有效率明显优于单用西药患者[11];另外在减轻肾损伤、缩短术后临床症状和提高疗效等方面取得了较为满意的疗效[12]。

当前循证医学研究已经证实了降糖药物通过调节糖脂代谢紊乱对糖尿病肾脏的保护作用,但是长期预后及安全性尚待进一步考察,药物不良反应也有所报道[13]。本研究采用高脂高糖饮食联合STZ诱导糖尿病早期肾损伤大鼠模型,与对照组比较,FBG水平和BUN、Cr、TC、TG水平均显著升高,且出现肾病理学损伤情况。通过滋肾通关方治疗4周后,发现糖尿病肾损伤大鼠FBG水平和BUN、Cr、TC、TG水平均明显降低,肾病理学损伤得到有效改善且随着剂量的增加效果更加显著。表明滋肾通关方对脂高糖饮食联合STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏损伤有潜在的治疗作用。

炎症是DN发病的主要因素。在糖尿病情况下,巨噬细胞等炎症细胞浸润肾脏,并创造一种炎症环境,几乎对所有的肾细胞产生有害影响,导致细胞外基质沉积、间质纤维化和细胞功能障碍,最终导致蛋白尿,不同的炎症成分,包括脂肪因子、Toll样受体、趋化因子、黏附分子和炎症介质,可能是DN等并发症发生的关键因素[14]。研究表明,肾病患者药物治疗后血清炎症标志物TNF-α、IL-6、IL-18水平显著降低,抗炎细胞因子IL-10水平显著升高[15]。近年来中医药医家针对DN的炎症反应探讨其病机特点,认为热邪与DN早期炎症反应密切相关,如肾小球血流量大、流速快、滤过功能亢进与中医“阳热亢进、热迫血行”表现相符合[16];结合微观辨证理论分析DN早期为肾络癥瘕形成的早期,热入肾络,邪正相争于肾之脉络,热伤气阴,肾络受损,炎症通路和炎症介质被激活[17]。可见阴虚为其病之本,内热为其病之标,本虚标实。传统中医常以“滋阴清热”立法,滋阴扶正,清热祛邪,以求标本兼治。滋肾通关方原方主治“不渴而小便闭,热在下焦血分”,方中黄柏色黄味苦,入肾经血分,泻下焦火;知母性寒,滋肾水以泻热;肉桂辛热,色赤入血,用以反佐,取中医“寒因热用”与“甘苦合化”之意,其主证与糖尿病肾损伤早期炎症反应的中医病机相符。本研究发现与对照组比较,模型组的大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平均显著升高,而滋肾通关方明显降低了糖尿病大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎症指标的水平,且随剂量的增加下降更明显。提示滋肾通关方治疗可能通过改善肾脏炎症环境而对肾脏起到保护作用。

TGF-β是一种多功能细胞因子,具有多种生理功能,TGF-β被认为是参与血管系统和肾脏纤维化疾病的关键纤维化细胞因子之一,其可通过转导和扩增炎症和纤维化信号促进肾病的进展[18]。TGF-β1/Smads信号通路被认为是肾纤维化发展的关键途径,TGF-β1与TGF-β Ⅱ型受体结合激活TGF-β Ⅰ型受体,导致Smad2和Smad3磷酸化,激活的Smad2和Smad3与Smad4形成复合物,从细胞质移动到细胞核,并在纤维化基因表达中发挥转录调节作用[19]。Smad3在纤维形成过程中高度激活,抑制性Smad7的表达显著下调。Smad3和Smad7之间平衡的改变导致肌成纤维细胞的积累和激活、细胞外基质的过度产生以及细胞外基质降解的减少。有研究认为,同时下调Smad3和上调Smad7表达有助于肾病模型中肾纤维化的治疗[20]。本研究中,与对照组比较,模型组大鼠的肾脏中TGF-β1和Smad3过表达,而Smad7的表达明显降低,提示了糖尿病大鼠肾脏可能发生纤维化。经过滋肾通关方治疗4周后,糖尿病大鼠肾脏TGF-β1/Smad信号明显减弱,提示滋肾通关方可能通过介导TGF-β/Smad信号,抑制了肾脏纤维化进程。另外肌成纤维细胞是引起胶原过度沉积、促进肾纤维化的主要细胞类型,α-SMA是肌成纤维细胞的标志,波形蛋白是肌成纤维细胞的标志成纤维细胞和平滑肌细胞骨架形成的基础。研究表明,抑制波形蛋白的表达有助于减少与上皮-间充质转化相关的肾纤维化的发展[21]。我们进一步检测了α-SMA和波形蛋白的表达,发现滋肾通关方明显降低了糖尿病大鼠肾脏中α-SMA和波形蛋白的过表达水平,进一步证明滋肾通关方可能抑制糖尿病大鼠肾脏纤维化的进展。

综上所述,滋肾通关方可明显减轻糖尿病大鼠肾脏损伤,改善肾功能,且呈浓度依赖性,其机制可能与滋肾通关方通过抑制TGF-β1/Smad信号通路降低炎症反应有关,从而阻止糖尿病大鼠肾纤维化进程,最终改善肾功能损害。

利益冲突声明:无。