督脉电针调控胱氨酸/谷氨酸反向转运体改善脑卒中后肢体痉挛的作用机制

张丽红 李瑞青 王艺莹 梅紧紧 苏凯奇 顾昌宇 黄梦玲

基金項目：国家中医药传承创新专项（2022CCCX010）；河南省科技研发计划联合基金项目（222301420066）；河南省重点研发与推广专项（科技攻关）（232102310470）；河南省中医学“双一流”创建科学研究专项课题（HSRP-DFCTCM-2023-8-34）

作者单位：1河南中医药大学（邮编450046）；2河南中医药大学第一附属医院康复中心

作者简介：张丽红（1998），女，硕士在读，主要从事中风等常见功能障碍的中医康复治疗及相关研究。E-mail：1176678542@qq.com

△通信作者 E-mail：lrq0424@163.com

摘要： 目的 探讨督脉电针对大脑中动脉阻塞再灌注（MCAO/R）后肢体痉挛大鼠大脑皮质中胱氨酸/谷氨酸反向转运体［System Xc（-）］的影响，并探讨其可能的作用机制。方法 选择SPF级雄性SD大鼠60只，随机分为空白组、假手术组及造模组。空白组不进行任何处理，假手术组仅分离血管，造模组采用大脑中动脉栓塞法制备MCAO/R大鼠模型，并于术后第3天进行Zea-Longa神经功能缺损评分、肌张力评定和电生理描记检测筛选肢体痉挛大鼠，造模组造模成功后随机分为模型组和督脉电针组。其中，督脉电针组于术后第3天开始治疗，每日1次，每次30 min，连续7 d。治疗结束后再次评定其神经功能及肌张力恢复情况；TTC染色测算脑梗死体积；干湿质量法检测各组大鼠脑含水量；比色法检测大脑皮质中谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和谷胱甘肽（GSH）浓度；蛋白免疫印迹（Western blot）法和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分别从蛋白和基因水平检测大脑皮质中血清溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、溶质转运蛋白家族3成员2（SLC3A2）、γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）和谷胱甘肽合成酶（GSS）的表达。结果 与模型组相比，治疗后督脉电针组大鼠神经功能缺损评分和改良Ashworth评分降低，肌电信号值增强，脑水肿程度减轻，脑梗死程度有所恢复，Cys和GSH含量显著增加，SLC7A11、SLC3A2、γ-GCS和GSS蛋白和mRNA的表达量显著提高，而Glu浓度显著降低（P＜0.05）。结论 督脉电针可以改善脑卒中后大鼠神经功能损伤和肢体痉挛程度，其机制可能与调控System Xc（-），改善Glu兴奋性毒性和氧化应激有关。

关键词：卒中；痉挛；督脉电针；胱氨酸/谷氨酸反向转运体

中图分类号：R743.3文献标志码：ADOI：10.11958/20231330

The mechanism of Du meridian electroacupuncture regulating cystine/glutamate reverse transporter to improve limb spasm after stroke

ZHANG Lihong1， LI Ruiqing2△， WANG Yiying1， MEI Jinjin1， SU Kaiqi2， GU Changyu1， HUANG Mengling1

1 Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450046， China; 2 Rehabilitation Center，

the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine

△Corresponding Author E-mail： lrq0424@163.com

Abstract： Objective To investigate the effect and mechanism of Du meridian electroacupuncture on cystine/glutamate reverse transporter [System Xc （-）] in cerebral cortex of middle cerebral artery occlusion/reperfusion （MCAO/R） model rats. Methods A total of 60 SPF male Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into the blank group， the sham operation group and the model group. The blank group did not do any treatment， the sham operation group only separated the blood vessels and the model group was prepared by middle cerebral artery embolization for MCAO/R rat model. On the third day after operation， Zea-Longa neurological deficit score， muscle tension evaluation and electrophysiological tracing were used to screen rats with limb spasm. After successful modeling， rats was randomly divided into the model group and the Du meridian electroacupuncture group. The Du meridian electroacupuncture group began treatment on the third day after operation， once a day for 7 days. After the end of treatment， the neurological function and muscle tension recovery were evaluated again. TTC staining was used to measure the cerebral infarction volume. The brain water content of rats in each group was detected by wet and dry weight method. The concentrations of glutamic acid （Glu）， cysteine （Cys） and glutathione （GSH） in cerebral cortex were detected by colorimetric assay kit. Western blot assay and quantitative real-time PCR （RT-qPCR） were used to detect the expression of SLC7A11， SLC3A2， γ-glutamylcysteine synthetase （γ-GCS） and glutathione synthetase （GSS） in cerebral cortex at the protein level and gene level， respectively. Results Compared with the model group， the neurological deficit score and modified Ashworth score were decreased in the Du meridian electroacupuncture group， the EMG signal value was enhanced， the brain water content was decreased， the degree of cerebral infarction was restored， the contents of Cys and GSH were significantly increased， the expression levels of SLC7A11， SLC3A2， γ-GCS and GSS protein and mRNA were significantly increased， and the concentration of Glu was significantly decreased （P＜0.05）. Conclusion Du meridian electroacupuncture can improve the degree of neurological impairment and limb spasm in rats after stroke. The mechanism may be related to the regulation of System Xc （-） and improving oxidative stress.

Key words： stroke; spasm; du meridian electroacupuncture; System Xc （-）

脑卒中后肢体痉挛（post-stroke spasticity，PSS）是速度依赖性的肌张力增强，伴有牵张反射兴奋性增高所导致的腱反射亢进为特征的一种临床表现［1-2］。流行病学结果显示，脑卒中后约有65%的患者发生肢体痉挛，已成为我国脑卒中患者运动功能恢复的最大障碍之一［3-4］，但其发病机制尚不明晰。谷胱甘肽（glutamine，GSH）是大脑中主要的抗氧化剂和氧化还原辅助因子，胱氨酸/谷氨酸反向转运体又称为System Xc（-）、xc系统或xCT，既是合成GSH的原料，也是细胞内重要的抗氧化元件。有研究发现，细胞外谷氨酸（glutamic acid，Glu）浓度升高产生兴奋性毒性，可抑制System Xc（-）的作用，导致Glu与胱氨酸转运异常，影响机体的氧化还原系统功能［5-6］。课题组前期研究表明，PSS大鼠皮质中胞外Glu浓度升高，而督脉电针可有效降低Glu兴奋性毒性，缓解痉挛及神经功能损伤［7-8］，但其具体机制尚不明确。本研究旨在探讨督脉电针对System Xc（-）的影响及其作用机制，为临床治疗PSS提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，6～7周龄，体质量200～220 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003。在干净通风的环境中饲养大鼠，自由获取食物和水，温度（23±2）℃，相对湿度为60%±10%。所有实验均按照动物实验伦理规范进行，伦理批件号：DWLL202110012。

1.2 主要试剂与仪器 总RNA提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和2% 2，3，5－三苯基氯化四氮唑（TTC）染液均购自上海雅酶生物医药科技有限公司，实时荧光定量PCR（RT-qPCR）试剂盒（美国ABclonal），血清溶质载体家族7成员11（recombinant solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）抗体（英国Abcam），溶质转运蛋白家族3成员2（solute carrier family 3 member 2，SLC3A2）抗体（Afinity），γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）抗体、谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS）抗体（Gene Tex），GAPDH抗体（武汉三鹰生物技术有限公司），反转录试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），Glu、GSH和半胱氨酸（Cysteine，Cys）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自伊莱瑞特生物科技有限公司。BL-420F生理记录仪（成都泰盟科技有限公司），华佗牌电针仪、φ0.35 mm×13 mm针灸针（苏州医疗用品厂有限公司），酶标仪（美国Thermo公司），离心机（Thermo ST16R），恒温脱色摇床（江苏海门时麒麟医用仪器厂），Image J生物医学图像分析软件（美国国家心理健康研究所）。

1.3 实验动物及分组 课题组前期预实验发现，大脑中动脉阻塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion ， MCAO/R）肢体痉挛模型大鼠的造模成功率为60%～70%，死亡率为20%左右。因此预测每组需要大鼠样本12只。大鼠适应性喂养后，将其体质量控制在250～280 g时进行实验。采用随机数字表法将SD大鼠分为空白组（n=12）、假手术组（n=12）及造模组（36只，包括模型组、督脉电针组）。造模组大鼠术前禁食禁水24 h后进行MCAO/R模型制备。

1.4 MCAO/R肢体痉挛模型大鼠制备 将大鼠称质量后腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，麻醉后颈部正中偏左位置切口，暴露并分离左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA）、颈外动脉（external carotid artery，ECA）。先用4-0缝合线结扎ECA以防后续插栓出血，并用动脉夹夹闭ICA的远心端。在CCA上剪一0.2 mm切口，将线栓一端沿切口处缓慢送入左侧CCA，当线栓头部送至分叉处时要注意务必送入ICA，当线栓顶部触到动脉夹时松开动脉夹，继续沿ICA缓慢推进约20 mm并伴轻微的阻塞感时停止进栓。栓塞2 h后拔出线栓，使血液实现再灌注，术后连续注射庆大霉素（2 U/只）3 d以预防感染。假手术组大鼠接受相同的手术方案，但不阻断ECA。待大鼠清醒后，将Zea-Longa神经功能缺损评分为1～3分、改良Ashworth量表1～4分大鼠视为造模成功。采用随机数字表法将造模成功大鼠分为模型组（n=12）及督脉电针组（n=12）。

1.5 电针选穴及治疗 督脉电针组在造模成功后第3天根据《实验针灸学》［9］选取督脉穴位行定位治疗。采用针灸针直刺入以下督脉穴位：“大椎”（第7颈椎与第1胸椎之间）、“脊中”（第11、12胸椎棘突之间）和“后会”（第6腰椎横突前内侧），深度2～3 mm，应用GM101电针仪与针柄相连，参数设置为密波频率100 Hz，电流强度1～3 mA，刺激30 min，每日1次，连续7 d。空白组、模型组及假手术组不做任何干预。

1.6 行为学检测 术后3 d和治疗7 d后分别采用（1）Zea-Longa神经功能缺损评分评价大鼠神经功能［10］；（2）改良Ashworth肌张力评分及电生理描记检测大鼠肌张力水平［11］；（3）电生理描记检测大鼠肌张力：各组大鼠麻醉后，将电极一端插入大鼠患侧后肢股四头肌，另一端插入大鼠尾部，将低顺应性棉线一侧连接到大鼠后肢的下端，另一侧通过张力传感器连接至BL-420F生理記录仪，给予0.59 g的后负荷，并以2 mA和30 s的规则间隔刺激股四头肌，数据由电生理记录仪采集，间接反映大鼠肌肉张力的变化，肌电信号值越低提示肌张力越高［12］。

1.7 病理学检测

1.7.1 TTC染色检测脑梗死体积 治疗7 d后使用戊巴比妥钠（40 mg/kg）对动物实施安乐死，每组随机抽取3只大鼠，取出完整脑组织，用预冷却的生理盐水冲洗，放置在洁净的培养皿中，置于-20 ℃冰柜中20 min，冰上分割为5片相邻的2 mm冠状切片，置于2%TTC溶液中37 ℃孵育30 min，待充分染色后拍照，结果采用Image J软件分析。计算梗死体积（%）=（切片梗死面积×厚度）/（切片整体面积×厚度）×100%。

1.7.2 脑水肿程度测定 采用干湿质量法测定脑水含量。解剖同侧和对侧半球，分离嗅球、脑干和小脑，记录湿质量，在烘箱中脱水并再次称质量获得干质量，以评估半球的脱水质量。脑含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。

1.8 分子生物学检测

1.8.1 比色法检测大脑皮质中Glu、Cys和GSH含量 每组随机抽取3只大鼠，麻醉取脑，并快速剥取左侧大脑皮质，将其均分为3份放入液氮中暂存，待取材结束再将皮质组织由液氮转入-80 ℃冰箱中冻存。根据比色法试剂盒说明书分别检测Glu、Cys和GSH水平，用酶标仪测定其光密度（OD）值进行分析。

1.8.2 Western blot法检测大脑皮质区SLC7A11、SLC3A2、γ?GCS和GSS蛋白的表达 每组3只大鼠各取100 mg大脑皮质组织，按比混合RIPA裂解液（100 mg加1 mL）匀浆至充分裂解后离心15 min，收集上清液用于蛋白提取。通过BCA蛋白质测定法测定蛋白浓度，然后对蛋白质样品进行凝胶电泳后转膜。5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加一抗SLC7A11（1∶5 000）、SLC3A2（1∶2 000）、γ-GCS（1∶3 000）、GSS（1∶2 000）和内参GAPDH（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶10 000），室温孵育1 h。滴入ECL超敏化学发光液后显影，条带灰度值用Image J软件记录并分析。以GAPDH为内参，目标蛋白相对表达量为目标条带与内参条带灰度值之比。

1.8.3 RT-qPCR法检测大脑皮质区SLC7A11、SLC3A2、γ-GCS和GSS mRNA表达 取适量皮质组织，采用TRIzol试剂提取大脑皮层总RNA。使用反转录试剂盒将RNA转化为cDNA，于-20 ℃环境保存。根据NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中SLC7A11、SLC3A2、γ-GCS、GSS和GAPDH基因序列设计引物（表1），武汉塞维尔生物科技有限公司设计合成。反应体系：2×Universal SYBR Green qPCR Supermix（10 μL），上、下游引物（各1.2 μL），cDNA（稀释5倍，0.5 μL）和无菌水（7.1 μL）。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40个循环，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算SLC7A11、SLC3A2、γ-GCS和GSS mRNA相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（[x] ±s）表示，干预前后比较采用配对样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较方差齐时行LSD-t检验，方差不齐时行Dunnetts检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学检测结果

2.1.1 Zea-Longa神经功能缺损评定结果 空白组与假手术组未进行MCAO/R造模，因此神经功能缺损评分为0分。干预前，模型组、督脉电针组神经功能缺损评分均高于空白组和假手术组（P＜0.05），提示造模成功。干预后，督脉电针组大鼠神经功能缺损评分较干预前降低，且低于模型组（P＜0.05），见表2。

2.1.2 大鼠改良Ashworth肌张力评定结果 空白组和假手术组肌张力为0级，提示大鼠肌张力正常，未出现痉挛。干预前，与空白组、假手术组相比，模型组和督脉电针组肌张力分级升高（P＜0.05），提示肌张力异常出现痉挛，即造模成功。干预后，督脉电针组肌张力分级较干预前降低，且低于模型组（P＜0.05），见表3。

2.1.3 电生理描记测定大鼠肌张力结果 假手术组肌电信号值与空白组差异无统计学意义，且2组干预前后差异无统计学意义（P＞0.05）。干预前，模型组和督脉电针组肌电信号值均低于空白组和假手术组（P＜0.05），提示肌张力增高，造模成功。干预后，督脉电针组肌电信号值较干预前上升，且高于模型组（P＜0.05），见表4。

2.2 病理学检测结果

2.2.1 TTC染色结果 4组大鼠脑梗死体积差异有统计学意义（F=137.000，n=12，P＜0.05）。空白组和假手术组均未出现脑梗死情况；模型组左侧大脑出现较大面积的梗死（40.36%±1.49%），督脉电针组左侧梗死体积（16.73%±0.20%）较模型组减少（P＜0.05），见图1。

2.2.2 大鼠脑水肿程度检测结果 4组大鼠脑含水量差异有统计学意义（F=188.300，n=3，P＜0.05）。假手术组脑含水量（76.44%±0.30%）与空白组（76.22%±0.37%）比较差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组脑含水量（81.43%±0.17%）高于空白组和假手术组（P＜0.05）；督脉电针组脑含水量（77.61%±0.34%）低于模型组（P＜0.05）。

2.3 分子生物学检测结果

2.3.1 大鼠大脑皮质中Glu、Cys和GSH含量 假手术组大鼠大脑皮质区Glu、Cys和GSH含量与空白组差异无统计学意义（P＞0.05）；模型組Glu含量高于空白组和假手术组，Cys和GSH含量低于空白组和假手术组（P＜0.05）；与模型组相比，督脉电针组Glu含量降低，Cys和GSH含量升高（P＜0.05），见表5。

2.3.2 大鼠大脑皮质中SLC7A11、SLC3A2、γ-GCS和GSS蛋白表达 假手术组大脑皮质中SLC7A11、SLC3A2、γ-GCS和GSS蛋白表达水平与空白组差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组上述蛋白表达水平低于空白组和假手术组（P＜0.05）；督脉电针组上述蛋白表达水平高于模型组（P＜0.05），见图2、表6。

2.3.3 各组大鼠大脑皮质中SLC7A11、SLC3A2、γ-GCS和GSS的mRNA表达 假手术组大脑皮质中SLC7A11、SLC3A2、γ-GCS和GSS的mRNA表达水平与空白组差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组大脑皮质中上述因子的mRNA表达水平低于空白组和假手术组（P＜0.05）；督脉电针组上述因子的mRNA表达水平高于模型组（P＜0.05），见表7。

3 讨论

祖国医学将脑卒中后肢体痉挛称为“拘痉”，该症属于中医学“痉症”范畴［13］。《素问·阴阳应象大论篇》曰：“清阳出上窍”“清阳实四肢”，阳气充足，筋脉得以柔养，则四肢屈伸灵敏；阳气不足，则见四肢拘急痉挛。督脉被称为“阳脉之海”，《难经》认为“督之为病、脊强而厥”，说明督脉病变与PSS关系密切。中医针灸理论中，“大椎”为手足三阳经、督脉之交会穴；“脊中”脉行于脊中，上贯入脑，为诸阳之海；“后会”穴与督脉之后顶穴位置相符，常作为百会之倒马针。三者同为督脉之要穴，诸脉合用，共奏补益阳气，调和气血，濡养经脉，疏通经络之效，使血随气运至全身、四肢，濡养肢体筋脉，或可缓解肢体痉挛［14-16］。课题组前期临床研究发现，督脉电针不仅能够明显改善脑卒中患者患侧上肢的痉挛情况，还可显著提高患者上肢的运动功能［8］，故本研究选取电针“大椎”“脊中”“后会”督脉三穴为PSS的主要疗法。

目前关于PSS的机制尚不清楚，一般认为痉挛是由兴奋性神经递质增加，抑制性神经递质减少，从而引起上运动神经元损伤后脊髓反射活动增高所致［17-18］。課题组前期研究结果表明，选取督脉穴位进行埋线可提高PSS大鼠脑组织中抑制性神经递质γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）含量，实现Glu和GABA两者之间的平衡，改善痉挛的情况［7，14］。本研究结果显示，当脑缺血发生时胞外Glu含量急剧升高，经督脉电针治疗后，大鼠神经功能缺损情况有所恢复；大脑梗死体积减小、脑血流量有所恢复并呈增多趋势；神经毒性脑水肿程度有所缓解；改良Ashworth肌张力分级和电生理描记结果显示，督脉电针组大鼠肌张力评分显著降低、肌电信号值显著增高，提示大鼠痉挛程度有所改善。此外，空白组和假手术组神经功能评分和改良Ashworth肌张力分级均为0，提示仅作血管的剥离、不进行插栓并不能影响大鼠的神经功能和肌张力水平。

System Xc（-）是一种不依赖钠的反向转运蛋白，通过与细胞膜上的Glu进行1∶1交换，介导细胞摄取胱氨酸用于GSH的生产和氧化保护，以换取Glu的输出［19-20］。System Xc（-）由轻链SLC7A11和重链SLC3A2组成，SLC7A11介导System Xc（-）的活性，而SLC3A2的作用则是将SLC7A11锚定在质膜上，维持SLC7A11蛋白的稳定性。有文献指出，SLC3A2同时参与了胱氨酸向细胞内的转运，影响该反向转运体的作用［21-22］。本研究结果显示，脑缺血发生后大脑皮质中Glu含量明显增多，且SLC7A11和SLC3A2的mRNA和蛋白表达水平明显降低，提示Glu堆积诱导的兴奋性毒性可能会抑制皮质中的System Xc（-），而督脉电针治疗后SLC7A11和SLC3A2的mRNA和蛋白表达水平有所上调，且Glu在皮质中的堆积情况有所改善。γ-GCS是GSH合成的限速酶［23］。Li等［24］研究发现，Cys在γ-GCS的催化作用下与Glu结合形成γ-谷氨酸半胱氨酸，随后GSS介导的甘氨酸分子酶加成，以产生GSH，改善了缺血性脑卒中后的氧化应激损伤。因此，调控System Xc（-）的表达可能成为PSS恢复的关键途径。本研究结果显示，脑缺血发生后，System Xc（-）表达下降，Cys含量因发生损耗大于供给而下降。同时，模型组大鼠皮质中GSH合成相关酶γ-GCS、GSS的mRNA和蛋白表达均下调，加之GSH合成的重要底物Cys表达减少，最终导致GSH含量下降，而督脉电针治疗后逆转了以上情况。

综上所述，本研究从System Xc（-）角度出发，分析卒中后痉挛的发病机制，证实了督脉电针治疗可以改善造模后大鼠皮质中Glu堆积情况，增加Cys含量，影响System Xc（-）的表达和转运功能，同时上调GSH合成相关酶γ-GCS、GSS的表达，进而增加GSH的合成，促进机体氧化还原水平的维护，保护机体微环境，进而改善PSS的形成和持续状态。

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（2023-09-18收稿 2023-11-24修回）

（本文编辑 陈丽洁）