棕色绿僵菌胞外酶的诱导及发酵液生化特性研究

李倩楠,马 园,郝陆瑶,张艳妮,郭志凯,丁玉林,杜 山,王 瑞

(内蒙古农业大学 兽医学院/国家级动物医学实验教学中心,内蒙古呼和浩特 010018)

家畜外寄生虫病是一类对世界各地畜牧业发展产生严重影响的疾病。家畜外寄生虫主要包括蜱、螨、虱和蝇等,但不同地区环境家畜外寄生虫的优势种类不同。蝇类除了侵扰人类、污染食物,其危害性更在于引发多种疾病、导致蝇蛆病的传播。蝇蛆病是指蝇类幼虫寄生在人体或动物组织和器官引发的疾病。据报道,我国已有300余例不同类型的蝇蛆病患者,其中多数是由属于狂蝇科和皮下蝇科的幼虫所引起的眼蝇蛆病和皮肤蝇蛆病。多年来,家畜外寄生虫病的防治措施多采取使用广谱化学药物杀虫,但随着驱虫药的大量泛用、滥用,也形成了药物残留、耐药性、环境污染和杀虫效率低等诸多问题。因此,怎样解决这些问题,寻求高效、简便的替代方法,是当今外寄生虫防治工作亟待解决的关键问题。其中,借助天敌防治外寄生虫病是一种极具潜力的寄生虫防治模式,被各国研究人员广泛探讨与深入研究[1-3]。

据统计,昆虫病原真菌可以感染5种目、24种科、200多种昆虫寄主,且其致病死亡率占所有病原微生物的60%[4]。在众多昆虫病原真菌中,棕色绿僵菌是一种广谱昆虫病原真菌,它能有效地减少宿主体表及环境中的外寄生虫,并且不会对环境造成污染、没有残留物、对人畜无害,因此可以用来进行大规模生物防治。昆虫的外表皮由蛋白质、几丁质和脂质等构成,蛋白质含量约占70%,几丁质嵌入在蛋白质基质中[5]。昆虫病原真菌可通过酶解和机械压力穿透寄主体壁侵入其体内。在此过程中,会产生蛋白酶、几丁质酶和脂酶等多种胞外酶,其中蛋白酶能够最先产生。因此,确定蛋白酶的活性是决定真菌侵染力的首要因素[6-7]。绿僵菌依靠其分生孢子附着在昆虫体表,利用氨基酸、蛋白质等营养物质萌发并分泌蛋白酶、几丁质酶[8-9]等穿透昆虫表皮,在昆虫体内迅速繁殖,释放出毒素[10]致使昆虫死亡[11]。此外,国外的研究发现在培养基中加入诱导物能够有效促进真菌蛋白质的产生。在之前的研究中,研究人员王瑞等[12-13]对少孢节丛孢菌和具有捕食线虫性质的真菌(Duddingtoniaflagrans)在应用不同的培养基和诱导物的发酵液下进行了蛋白质诱导和杀虫效果的研究。研究结果表明,培养基及诱导物的不同会影响到少孢节丛孢菌和Duddingtoniaflagrans的代谢过程。因此,本试验旨在分析不同培养基和诱导物对棕色绿僵菌产生胞外蛋白质的诱导效果以及发酵液的生化特性。通过此次研究,可以为今后深入探索棕色绿僵菌在液体培养发酵液中产生的杀虫相关物质和作用机理提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 待试菌株为棕色绿僵菌(Metarhiziumbrunneum)KVL04-57,保存于-80 ℃低温冰箱,由内蒙古农业大学兽医学院寄生虫学实验室提供;待试蝇蛆为家蝇三期幼虫,采自内蒙古牧区健康羊只新鲜粪便;待试草原革蜱(Dermacentornuttalli),采集于内蒙古四子王旗。

1.1.2 主要试剂 K2HPO4·3H2O、FeSO4·7H2O、明胶、吐温-80、蛋白胨,天津市科盟化工工贸有限公司产品;葡萄糖、硫酸铵、琼脂粉、MgSO4·7H2O、KH2PO4、Tris、Glycine、SDS、甲醇、冰醋酸、偶氮酪蛋白、酵母提取物、考马斯亮蓝R-250、异丙醇、三氯乙酸、NaOH,天津风船化学试剂科技有限公司产品;SDS-PAGE凝胶试剂盒、Brodford蛋白浓度测定试剂盒、碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒与酸性磷酸酶(ACP)测定试剂盒,上海科艾博生物技术有限公司产品;马铃薯,农贸市场购置。

1.1.3 培养基 萨氏培养液SDY(Sabouraud dextrose medium with yeast extract)、马铃薯液体培养基PD(potato dextrose)、枸橼酸液体培养基。

1.1.4 主要溶液 5×蛋白缓冲液、孢子洗脱液、预染液、考马斯亮蓝染色液、脱色液等。

1.1.5 主要仪器 超净工作台(CW-CT-27-D),苏州净化设备有限公司产品;全自动高压锅(XFH-30CA),上海天美仪拓实验室设备有限公司产品;生化培养箱(SP-02),上海赫田科学仪器有限公司产品;分析天平(AY120),岛津企业管理(中国)有限公司产品;智能摇床(BSD-YX2400),上海赫田科学仪器有限公司产品;垂直电泳槽和电泳仪(KEEBIO-VE 180),北京通世华港设备有限公司产品;凝胶成像系统(BioSpectrum),北京深蓝云生物科技有限公司产品;酶标仪(Biotek ELX800),美谷分子仪器(上海)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 棕色绿僵菌发酵液的制备与收集 萨氏发酵液的制备:取已经高压灭菌的萨氏培养液4份,其中3份分别加入定量灭菌后的蝇蛆三期幼虫、草原革蜱、终质量浓度为0.05 g/L的苯丙氨酸和缬氨酸混合液(1∶1)作为诱导物,第4份添加蒸馏水作对照。之后把棕色绿僵菌孢子混悬液用孢子洗脱液稀释至1×107个/mL,吸取 1 mL孢子混悬液分别加入到各个培养基内,在26 ℃、180 r/min恒温摇床中培养。隔天按时观察,7 d后用高压后的滤纸过滤,收集棕色绿僵菌发酵液,所得发酵液保存于4 ℃冰箱。

马铃薯液体发酵液的制备:同萨氏发酵液的制备过程。

枸橼酸液体发酵液的制备:同萨氏发酵液的制备过程。

1.2.2 棕色绿僵菌发酵液菌的SDS-PAGE分析 按照规定程序制备12%分离凝胶和6%浓缩凝胶[12-13]。电泳开始时,先设置电压为80 V进行电泳,当指示剂从浓缩胶完全移动到分离胶后,将电压调整为130 V继续电泳。到溴酚蓝移动到间隔分离胶底端近1 cm时,中止电泳。接着,用考马斯亮蓝染液染色6 h,倒入脱色液脱色过夜。脱色后出现清晰可见的蛋白质条带后,照胶拍照。

1.2.3 棕色绿僵菌发酵液中蛋白质含量的测定 根据Brodford蛋白浓度测定试剂盒说明书对制备好的发酵液中蛋白质浓度进行检测。

1.2.4 棕色绿僵菌发酵液中蛋白酶活性的测定 在1.5 mL无菌、无酶离心管中将25 μL发酵液吸取到管中,每种发酵液均设置3个平行样本。随后,向每个离心管中加入500 μL的偶氮酪蛋白溶液(pH 7,浓度为5 mg/mL)。将样品混匀后,在37℃水浴锅中水浴1 h,水浴结束后加入200 μL的三氯乙酸溶液中止反应,放入离心机以13000 r/min离心4 min后收集上清,将0.5 mL 1 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L离心后的上清液加入新的离心管中并充分混合。吸出300 μL加入96孔板中,在酶标仪预热30 min后将96孔板放入,检测波长为450 nm时的吸光值。在空白对照组中,使用蒸馏水代替发酵液,其余步骤与上述相同。通过获得的吸光度值计算蛋白酶活性(U/mL)。计算公式如下:

1.2.5 棕色绿僵菌发酵液中磷酸酶活性的测定 按照碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒和酸性磷酸酶(ACP)测定试剂盒说明书操作步骤进行检测。

1.2.6 棕色绿僵菌发酵液杀蝇蛆毒性试验 将棕色绿僵菌发酵液分为12个试验组,并将PBS(phosphate buffered saline)牛血清白蛋白溶液设置为对照组,每组均含有10只三期幼虫蝇蛆。将收集的蝇蛆三期幼虫,分别放入无菌平皿中,采用浸渍法,将蝇蛆在发酵液中停留15 s然后再将蝇蛆放入无菌培养皿中,盖上4层潮湿纱布后放入4 ℃冰箱过夜。24 h后等到平皿恢复到室温时,察看虫体活力和形态,并统计死亡率。

数据处理 :根据观察计算接种发酵液蝇蛆三期幼虫的死亡率。

1.2.7 数据统计与分析 试验数据使用Microsoft Excel 2013软件整理,试验数据用“平均值±标准差”来表示。

2 结果

2.1 棕色绿僵菌发酵液的SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE分析不同培养基及诱导物培养的PD、枸橼酸、SDY发酵液,结果详见图1。泳道1至4显示出两条明显的条带,分别位于25 ku和30 ku左右,而第4泳道的条带最为清晰。另外,泳道5至8分别展现出在14 ku、25 ku、40 ku和70 ku左右位置具有明显的条带,这表明枸橼酸培养基所产生的蛋白种类较为丰富。从图2可以看出,第1至第4泳道在约20 ku、25 ku和30 ku处呈现出清晰的条带。

M.蛋白分子质量标准;1.PD培养基对照组;2.氨基酸诱导的PD培养基组;3.草原革蜱诱导的PD培养基组;4.蝇蛆三龄幼虫诱导的PD培养基组;5.氨基酸诱导的枸橼酸培养基组;6.草原革蜱诱导的枸橼酸培养基组;7.蝇蛆三龄幼虫诱导的枸橼酸培养基组;8.枸橼酸培养基对照组

M.蛋白分子质量标准;1.SDY培养基对照组;2.蝇蛆三龄幼虫诱导的SDY培养基组;3.氨基酸诱导的SDY培养基组;4.草原革蜱诱导的SDY培养基组

2.2 棕色绿僵菌发酵液中蛋白质浓度的测定

通过表1可得知,培养棕色绿僵菌的不同液体培养基中,蛋白质浓度差异较大。其中,枸橼酸发酵液中的蛋白质浓度高于PD发酵液及SDY发酵液。此外,不同诱导物诱导的同种培养基中,发酵液蛋白质浓度亦有所不同。以蝇蛆三期幼虫和草原革蜱为诱导物的发酵液,蛋白质含量高于氨基酸诱导组,且均超过对照组。

表1 棕色绿僵菌发酵液中蛋白质含量和蛋白酶活性测定结果

2.3 棕色绿僵菌发酵液中蛋白酶活性的测定

由表1可知,枸橼酸培养基组蛋白酶活性高于SDY培养基组,其中蝇蛆三期幼虫诱导的枸橼酸培养基组蛋白酶活性最高,SDY培养基对照组蛋白酶活性最低。

2.4 棕色绿僵菌发酵液中磷酸酶活性的测定

据表2所示,使用枸橼酸培养基进行诱导,磷酸酶活性普遍高于PD培养基组和SDY培养基组。在3个组不同的培养基中,加入诱导物的培养组磷酸酶活性均高于对照组。不同诱导物的添加对磷酸酶活性有明显的影响。其中,加入蝇蛆三龄幼虫的培养基组磷酸酶活性最高,显著高于其他组;而加入草原革蜱的培养基组次之(但SDY培养基组的碱性磷酸酶活性除外),对照组培养基磷酸酶活性最低。总体来看,以寄生虫体为诱导物的培养基的磷酸酶活性高于以氨基酸为诱导物的培养基。

表2 棕色绿僵菌发酵液中磷酸酶活性测定结果

2.5 棕色绿僵菌发酵液杀蝇蛆毒性试验

由表3可知,棕色绿僵菌发酵液含有对蝇蛆三期幼虫有杀灭作用的成分。不同的培养基和诱导物对棕色绿僵菌发酵液的杀虫效果有所不同。加入诱导物后,发酵液杀虫效果显著。其中,以寄生性虫体作为诱导物的发酵液效果更佳,优于氨基酸组。

表3 棕色绿僵菌发酵液杀蝇蛆毒性试验结果

3 讨论

近期研究表明,棕色绿僵菌的发酵液受培养基和诱导物的影响较大。这些因素对胞外蛋白质种类、含量、以及蛋白酶和磷酸酶的活性都会产生显著影响。在不同的组培养基中,枸椽酸培养基组的胞外蛋白质含量最高,远高于PD培养基组和SDY培养基组。针对同一种培养基不同种类的诱导物,以蝇蛆三期幼虫为诱导物的培养基组所产生的胞外蛋白质含量高于以氨基酸为诱导物的培养基组。同时,将寄生性虫体蝇蛆三期幼虫和草原革蜱诱导物加入培养基组,相较于不加入寄生性物质的氨基酸诱导物,胞外蛋白质含量更高。蝇蛆三期幼虫诱导的枸椽酸培养基组所产生的蛋白质含量最高,说明不同的培养基和诱导物种类在真菌代谢过程中起到了决定性作用。SDS-PAGE凝胶电泳图明显展示在含寄生性虫体培养基中,产生的蛋白质条带更为明显,表明寄生性虫体更能够有效诱导棕色绿僵菌蛋白质的产生。实验表明,棕色绿僵菌在枸橼酸培养基中酸性磷酸酶活性较高,碱性磷酸酶活性则是PD培养基中较高。与对照组相比,添加诱导物培养基磷酸酶活性明显增加。可见,不同的营养成分和诱导物可以改变棕色绿僵菌的代谢过程。

据发现,棕色绿僵菌发酵液对蝇蛆具有一定的杀灭作用。研究表明,在真菌的侵染增殖过程中,会在液体培养基中会释放出具有杀虫毒性的活性成分,例如绿僵菌毒素,是绿僵菌分泌的一种次生代谢产物,与绿僵菌侵染昆虫并导致其死亡有紧密相连的关系。FERRON P.[14]认为,昆虫感染真菌后,其病原菌毒素可能引起某些致病效应,从而加速昆虫的死亡过程,这可能是昆虫真菌感染后死亡的真正原因之一。据研究报道,真菌代谢受诱导剂影响显著,同时培养基中诱导物剂量越高,真菌代谢物产量越高[15]。

蝇蛆三期幼虫的致死率受到不同培养基的影响,即使使用相同种类的培养基,不同的诱导物也会导致其相应的致死率不同,毒杀作用也会因此存在较大差异。试验结果确认了此结论。在棕色绿僵菌3种发酵液中,蝇蛆三期幼虫以枸橼酸培养基为诱导剂时,毒性最强,蛋白质含量和蛋白酶活性最高。相反,PD培养基对照组杀蝇蛆活性较低,但蛋白质含量和蛋白酶活性均高于蝇蛆三期幼虫、草原革蜱和氨基酸诱导的SDY培养基组。分析发现,棕色绿僵菌代谢过程会受到培养基成分影响,导致代谢产物的分泌发生变化。因此,在研究真菌及其代谢产物时,需要充分考虑培养基组成及诱导物种类,因其对真菌的代谢过程起关键作用。

综上所述,不同培养基和诱导物确实会显著影响棕色绿僵菌的代谢过程,导致其胞外蛋白质种类和含量、蛋白酶和磷酸酶活性及杀蝇蛆毒性产生差异。本研究确定了棕色绿僵菌胞外蛋白质的最佳培养基为枸橼酸液体培养基,同时发现对蝇蛆三期幼虫的诱导作用最好,这些结果为今后有关该菌胞外蛋白质的研究提供了重要参考资料。