4种绿僵菌乙酸乙酯初提物抗菌活性比较

华梅,王垚,肖支叶,原晓龙,王娟,杨宇明,王毅

(1.云南省林业科学院,云南 昆明 650201;2.云南省森林植物培育与开发利用重点实验室/国家林业局云南珍稀濒特森林植物保护和繁育实验室,云南 昆明 650201;3.云南大学 中草药生物资源研究所云百草实验室,云南 昆明 650091;4.西南林业大学 材料工程学院,云南 昆明 650224)

绿僵菌属于半知菌亚门丛梗孢目瘤座孢科绿僵菌属(MetarhiziumSorokin)真菌，是1种具有很强致病性的昆虫病原真菌，能寄生于螨类和线虫体内，共包含13个种[1-3]。目前对绿僵菌属真菌的研究主要集中在以下几个方面：绿僵菌的分离鉴定、固态发酵、液体深层发酵及作为环境友好的真菌杀虫剂等。杜开书等[4]、张亚波等[5]对1株绿僵菌进行分离鉴定，并对其生物学特性进行研究，经培养特征和形态学鉴定确定此绿僵菌为金龟子绿僵菌(M.anisopliae)。研究人员对绿僵菌的固相发酵及液态深层发酵条件进行了研究，分析液体培养基、固体培养基及其厚度、浅盘固体发酵、袋装固体发酵对金龟子绿僵菌生长及产孢量的影响[6-9]。除此之外，研究了绿僵菌对土壤害虫的防治[10]、草原蝗虫(Chorthippusspp.)防治[11]、马尾松毛虫(Dendrolimuspunctatus)防治[12]及花生蛴螬(Holotrichiaparallela)的致病力[13]。目前，以绿僵菌为代表的昆虫病原真菌已被开发为环境友好的真菌杀虫剂。

以冬虫夏草、蛹虫草为代表的昆虫病原真菌具有良好的医药保健功能，研究人员曾对虫生真菌生防效果及其代谢产物活性进行了研究[14]。对绿僵菌代谢产物进行研究发现绿僵菌代谢产物中含有聚酮化合物[15-16]、苦马豆素[17]、生物碱[18]等有效成分。绿僵菌代谢产物还具有提高免疫力、抑制肿瘤、抗突变、抗辐射、抗氧化等生物活性[19-21]。绿僵菌代谢产物具有一定的抑菌潜能，焦彦朝等人发现戴氏虫草(Cordycepstaii)的无性型—戴氏绿僵菌(Metarhiziumtaii)88-601菌株菌丝体乙醚浸提液对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草杆菌(B.subtilis)有明显的拮抗作用[22-23]。从已报道的对绿僵菌的研究来看，主要集中于金龟子绿僵菌及戴氏绿僵菌的研究。除杨俐等[24]对贵州绿僵菌(M.guizhouense)固态发酵产壳聚糖酶有一系列的研究外，对绿僵菌其余种在化学成分和生物活性方面的研究还存在大量的空白。

本研究拟采用液体深层发酵技术，对虫草中分离出的4种绿僵菌进行液体培养。培养获得的绿僵菌培养液经乙酸乙酯处理后，得到绿僵菌初提物。将绿僵菌初提物分别对13种致病菌进行活性筛选，以期找到能产生抗菌效果的绿僵菌，为下一步大量培养抗菌型绿僵菌真菌，分离提纯抗菌活性化合物及功能基因的研究作铺垫。

1 材料与方法

1.1 实验材料

4株从虫草中分离得到的绿僵菌由云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室虞泓教授馈赠，经形态及ITS鉴定为黄绿绿僵菌(M.flavoviride)、贵州绿僵菌、棕色绿僵菌(M.brunneum)、金龟子绿僵菌。

1.2 供试菌种

蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、无乳链球菌(Streptcococcusagalactiae)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、福氏志贺氏菌(Shigellaflexneri)、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、 副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、 溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)、铜尿假单胞菌 (Pseudomonasaeruginosa)、乙型副伤寒沙门氏菌(SalmonellaparatyphiB)、大肠埃希菌(Escherichiacoilcoli)。13种供试菌种由昆明市食品药品检验所赠送。

1.3 实验方法

1.3.1 4种绿僵菌菌种的活化

配制MY固体培养基(麦芽糖提取物20g，葡萄糖6g，酵母提取物2g，琼脂8g，用水定容至1L)，灭菌冷却后，在无菌条件下，钩取已经鉴定好的母种绿僵菌接于斜面培养基上，于28℃恒温暗培养，待菌丝长满斜面后用于绿僵菌菌丝体的液体培养。

1.3.2 绿僵菌菌丝体的液体培养

将4种绿僵菌菌丝体分别接种于100mL的OMAM液体培养基(大豆蛋白胨20g，葡萄糖20g，酵母提取物1g，蔗糖20g,用水定容至1L)中，置于28℃，转速为150r/min的摇床中培养10d。

1.3.3 绿僵菌初提物的提取

在4种绿僵菌培养物中分别加入100mL的乙酸乙酯，振荡混匀，于室温下超声提取1h。将绿僵菌初提液倒入4层纱布中过滤，去除绿僵菌菌丝体。滤液在分液漏斗中混合均匀，静置过夜分液，后取上层液用旋转蒸发仪浓缩致干，称重，加入二甲基亚砜(DMSO)做抗菌活性筛选。

1.3.4 绿僵菌初提物抑菌活性检测

13种供试细菌菌株悬浮液的制备、滤纸片法筛选绿僵菌初提物的抑菌活性及二倍稀释法对最低抑菌活性(MIC)的测定方法参照文献[25-27]。

1.3.5 绿僵菌初提物抑菌活性生物学重复

将活化的4种绿僵菌菌种分别按照菌丝体液体培养的方法平行培养各3瓶，培养物均按照1.3.3的方法进行提取，所得乙酸乙酯初提物按照1.3.4的方法进行抑菌活性检测。

2 结果与分析

2.1 绿僵菌乙酸乙酯萃取初提物的得率及被试液浓度

4种绿僵菌培养液经1︰1乙酸乙酯萃取后初提物的得率及DMSO溶解后被试液浓度见表1。从表1可以看出，绿僵菌乙酸乙酯初提物平均得率最高的为棕色绿僵菌，得率为3.112mg/mL。

2.2 绿僵菌乙酸乙酯初提物抑菌活性

将4种绿僵菌分别在OMAM液体培养基中培养，采用乙酸乙酯萃取后得初提物，将4种绿僵菌初提物对13种致病细菌进行抗菌活性筛选，抑菌效果见表2。

表1 4种绿僵菌萃取液得率及被试液浓度 (means±SD,n=3)Tab.1 Extraction yield of four species of Metarhizium and concentration of the test solution

从表2可知，4种绿僵菌乙酸乙酯初提物具有一定的抗菌活性，其中黄绿绿僵菌初提物对蜡样芽孢杆菌和缓慢芽孢杆菌具有抑制作用，贵州绿僵菌初提物对蜡样芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌和溶血性葡萄球菌具有抑制作用，棕色绿僵菌初提物对蜡样芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、溶血性葡萄球菌、副溶血性弧菌、藤黄微球菌产生抑制效果，金龟子绿僵菌对蜡样芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌产生抑制。4种绿僵菌均对蜡样芽孢杆菌和缓慢芽孢杆菌产生抑制作用，抑菌效果最好的为金龟子绿僵菌，抑菌圈直径分别为10.02±0.07mm和12.53±0.02mm。棕色绿僵菌和金龟子绿僵菌均对副溶血性弧菌革兰氏阴性菌产生抑制作用，金龟子绿僵菌抑制效果较好。除了黄绿绿僵菌外，其余3种绿僵菌均对溶血性葡萄球菌阴性菌产生抑制作用，由金龟子绿僵菌液体培养后所产生的粗提物的抑菌效果最好。仅有棕色绿僵菌产生的代谢产物能对藤黄微球菌产生抑菌效果。4种绿僵菌对表2中所列的5种供试菌有抗菌活性，对其余8种供试菌均不具有抗菌活性。综上所述，4种绿僵菌中，金龟子绿僵菌具有较好的抗菌活性。

表2 4种绿僵菌乙酸乙酯粗提物抑菌活性(means±SD,n=3)Tab.2 Antibacterial activities of ethyl acetate extracts from 4 species of Metarhizium

2.3 绿僵菌抗菌初提物MIC

采用二倍稀释法，对4种绿僵菌初提物进行逐级稀释，分别滴加10μL不同浓度的4种绿僵菌初提物稀释液于试验样片，滴加10μL原始浓度的4种绿僵菌作为阳性对照，滴加10μL DMSO液作为阴性对照。将试验样片和对照样片贴放培养皿表面与相应致病菌进行MIC测定，结果见表3。

表3 4种绿僵菌提取物MIC测定Tab.3 The minimum inhibitory concentration (MIC) of ethyl acetate extracts from 4 Metarhizium spp. mg/mL

从表3中可以看出，同种绿僵菌所产生的次级代谢产物对不同的供试细菌的最低抑制浓度各不相同，不同绿僵菌所产生的次级代谢产物对相同的供试细菌的最低抑制浓度也各不相同。贵州绿僵菌对蜡样芽胞杆菌和缓慢芽孢杆菌的最低抑制浓度为6.45mg/mL，对溶血性葡萄球菌的最低抑制浓度为3.23mg/mL(为4种绿僵菌中对对应细菌最低的MIC)。金龟子绿僵菌对副溶血性弧菌的最低抑菌浓度为6.86mg/mL。棕色绿僵菌对5种细菌均有抑制作用，对藤黄微球菌的最低抑菌浓度为13.9mg/mL。

3 结论与讨论

昆虫内生真菌次级代谢产物具有广泛的生物活性，从已报道的几株昆虫内生真菌的次级代谢产物中分离到多种具有抗菌、抗肿瘤及抗氧化的活性化合物[28]，同时发现昆虫内生真菌对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有较强的抑菌活性。

虫草是一种传统的名贵中药材，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等广泛的药理作用[29]。随着经济水平的不断提高，人们对虫草市场需求与日俱增，在利益的驱动下，虫草野生资源濒临枯竭。研究表明，人工发酵培养得到的菌丝体与天然冬虫夏草在活性组分、药理作用等方面具有高度相似性。绿僵菌为虫草虫体部位的内生真菌，绿僵菌代谢产物具有一定的抑菌潜能，已报道戴氏虫草的无性型—戴氏绿僵菌88-601菌株菌丝体乙醚浸提液对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、枯草杆菌有明显的拮抗作用[23]。

本研究采用液体发酵培养的方法，将虫草中分离得到的4种绿僵菌进行液体培养，培养液经乙酸乙酯处理后旋干得初提物。采用抑菌圈法对4种绿僵菌乙酸乙酯初提物进行抑菌活性研究，结果发现4种绿僵菌均具有一定的抑菌活性，棕色绿僵菌初提物同时对5种供试细菌产生抑制作用，其中对藤黄微球菌的最低抑菌浓度为13.9mg/mL。贵州绿僵菌初提物对蜡样芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌和溶血性葡萄球菌具有抑制作用，对溶血性葡萄球菌的最低抑菌浓度为3.23mg/mL。贵州绿僵菌提取物对蜡样芽胞杆菌的最低抑菌浓度(MIC 6.45mg/mL)明显优于南五味子(Kadsuralongipedunculata)乙醇提取物(MIC 15.62mg/mL)及甜叶菊(Steviarebaudiana)废渣提取物(MIC 12.5mg/mL)对蜡样芽胞杆菌的最低抑菌浓度[30-31]。黄绿绿僵菌初提物对蜡样芽孢杆菌和缓慢芽孢杆菌具有抑制作用，对缓慢芽孢杆菌的最低抑制浓度为16.5mg/mL。金龟子绿僵菌初提物对蜡样芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、副溶血性弧菌、溶血性葡萄球菌产生抑制，对后3种细菌的最低抑菌浓度均为6.86mg/mL。因4种绿僵菌均具有不同程度的抑菌效果，可进行菌丝体大量的液体培养，获得较多的抗菌初提物，以期分离纯化其中的抗菌化合物，对抗菌化合物进行分析和鉴定，为开发虫生真菌抗菌剂奠定基础。

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