紫锥菊多酚-纳米银复合物的绿色制备及表征

陈君霖,赵昕钰,廖 琳,左景茹,杜婧怡,葛骏枭,赵一凡,余 娅,刘晓强

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100)

纳米药物是纳米技术与药学相结合后研发出的一种新剂型,与其他剂型比较,粒径更小,比表面积更大,表面反应活性更高,活性中心更多[1]。纳米制剂提高了中药的溶解度、生物利用度、药物疗效、缓释控释作用和靶向作用,降低了毒性和副作用,减少了药物使用药量,具有很好的生物相容性[2]。纳米银是纳米材料研究的热点之一,银离子自身的抗菌能力使其在生物医疗研究领域具有巨大的潜力[3]。纳米银合成手段有化学、物理、生物3种途径,化学还原法会产生大量污染物,破坏生态环境。绿色还原法在制备过程中不会在纳米粒子表面吸附有毒有害物质,对环境危害小,而且材料粒径均匀,产生的银团聚物少[4]。黄酮类化合物、萜类化合物、生物碱、多酚类等天然成分都可用于绿色还原法制备纳米银[5]。还原剂使Ag+还原为Ag,可吸附在纳米银表面避免团聚[6]。紫锥菊属于菊科松果菊属,分布于北美、欧洲、澳大利亚和中国[7],被用于治疗许多疾病[8]。紫锥菊多酚为菊科植物紫锥菊的茎叶、根提取物。从紫锥菊分离鉴定出的多酚类物质主要以咖啡酸衍生物为主[9]。紫锥菊多酚的生物学效应主要依赖于其自身所含的植物化学物质如菊苣酸、绿原酸、咖啡因、紫锥菊皂等[10],目前主要作为免疫调节剂及免疫刺激素,具有抗病毒、抗真菌、抗肿瘤及杀虫、消炎的药理作用,常用于治疗呼吸道疾病[11]。

目前,国内紫锥菊常见兽用制剂有片剂、胶囊、粉末与口服液等,关于紫锥菊纳米制剂的研究尚未报道,紫锥菊多酚在纳米银合成过程中充当还原剂和表面活性剂,能制成大小均匀、比较稳定的纳米银。本文通过研究紫锥菊多酚纳米银复合物的制备方法及对其质量评价,以提高药物的有效性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 紫锥菊多酚(纯度≥99%),陕西省扶风县斯诺特生物科技有限公司产品(批号20220507)。

1.1.2 主要试剂 硝酸银(纯度≥99.8%),成都市科隆化学品有限公司产品;聚乙烯吡咯烷酮(PVP),索莱宝科技有限公司产品;硼氢化钾(KBH4),上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品;碳酸氢钠(纯度≥99.5%),广东光华科技股份有限公司产品;乙二胺四乙酸(EDTA),索莱宝科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 紫外-可见分光光度计(UV-2550),岛津(上海)实验器材有限公司产品;TGL-16M型台式高速冷冻离心机,湖南凯达科学仪器有限公司产品;纳米激光粒度仪(ZEN360003060120),英国马尔文仪器有限公司公司产品;透射电子显微镜(TECNAIG2 SPIRIT BIO03040112),美国FEI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 试剂配置 取1.1891 g AgNO3粉末,350 mL去离子水溶解,配成0.02 mol/L的AgNO3溶液;取0.25 g紫锥菊多酚加入50 mL去离子水,超声震荡溶解,得到5 g/L的紫锥菊多酚溶液;取0.15 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入50 mL去离子水,得3%的PVP溶液;取0.001 g KBH4溶于100 mL去离子水中,得到0.01% KBH4溶液。

1.2.2 化学合成法 将10 mL 0.02 mol/L AgNO3溶液与10 mL 3% PVP溶液混合,放入转子,置于磁力搅拌器上搅拌1 h,同时将50 mL 0.01% KBH4溶液用注射器逐滴滴入,溶液由无色变为淡黄色。

1.2.3 绿色合成法 将AgNO3溶液放入烧杯中,放入转子,将紫锥菊多酚溶液逐滴加入硝酸银溶液中搅拌,溶液由淡黄色变为深棕色。

1.2.4 合成工艺优化

1.2.4.1 容积比 AgNO3浓度按紫锥菊多酚(5 g/L):AgNO3溶液(0.02 mol/L)的体积比为1∶9、3∶7、5∶5、7∶3、9∶1制备紫锥菊多酚纳米银复合物,反应物总体积为50 mL。将紫锥菊多酚溶液逐滴加入硝酸银溶液中,搅拌1 h,采用紫外-可见分光光度计考察溶液在300～800 nm波长处的吸收情况。

1.2.4.2 AgNO3浓度 将硝酸银溶液倍比稀释,分别得到0.02、0.01、0.005、、0.002 5、0.001 25 mol/L的硝酸银溶液,取硝酸银溶液35 mL,放入转子,将15 mL紫锥菊多酚溶液(5 g/L)逐滴加入硝酸银溶液中,搅拌1 h,采用紫外-可见分光光度计考察溶液在300～800 nm波长处的吸收情况。

1.2.4.3 反应时间 将60 mL紫锥菊多酚溶液(5 g/L)逐滴加入140 mL硝酸银溶液(0.02 mol/L)中,搅拌2 h,在0、30、60、90、120 min时取溶液40 mL,采用紫外-可见分光光度计考察溶液在300～800 nm波长处的吸收情况。

1.2.4.4 反应温度 将60 mL紫锥菊多酚溶液(5 g/L)逐滴加入140 mL硝酸银溶液(0.02 mol/L)中,分别放置在25、40、60、80、100℃温度条件下反应2 h,采用紫外-可见分光光度计考察溶液在300～800 nm波长处的吸收情况。

1.2.5 透射电镜 用透射电子显微镜(TEM)对纳米银复合物进行观察。

1.2.6 粒径与Zeta电位 取1 mL紫锥菊多酚纳米银复合物置于粒径样品池中,放入马尔文纳米激光粒度仪内,测定其粒径分布及多分散指数(PDI)。取同样稀释后的脂质体样品0.8 mL,缓慢注入Zeta电位样品池中,放入马尔文纳米激光粒度仪内,测定其Zeta电位值。

1.2.7 包封率 配制125、100、80、50、40、20、10 mg/L浓度梯度的紫锥菊多酚溶液,进行稀释后使用紫外分光光度计在218 nm处测定吸光度,制备标准曲线。取紫锥菊多酚-纳米银复合物9 mL于离心管内,于4 000 r/min离心30 min,取一定量的上清液,测定吸光度,包封率按照以下公式进行计算:

包封率=(1-总药量/游离药量)×100%

1.2.8 体外释放率 把透析袋剪成10～20 cm小段,在2%碳酸氢钠和1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA,pH 8.0)溶液中将透析袋煮沸10 min。将透析袋剪成单层后放在1 mmol/L的EDTA(pH 8.0)溶液中煮沸10 min。冷却后置于4℃ 冰箱。接收池中注满接收液,调温为37℃。加热,转速为300 r/min。分别于不同时间取样3 mL,接收液补足。取出样品于4℃冰箱中保存,紫外分光光度计检测其吸收波长。按照公式推算累计释放量百分数:

累计释放率=[Ck×V1+(C1+C2+……Ck-1)×V2]/M×100%

C1、C2、Ck-1分别表示在第1、2、k-1时间点处取样的浓度,V1代表总体积,V2代表取样体积。

1.2.9 稳定性 按照上述最佳工艺制备紫锥菊多酚-纳米银复合物,置于4℃避光保存,将复合物稀释后,每隔24 h吸取3.5 mL至石英比色皿中,使用紫外分光光度计检测溶液在448 nm处的吸光度。

2 结果

2.1 合成工艺的优化

2.1.1 确定最大吸收波长 取紫锥菊多酚溶液、硝酸银溶液、紫锥菊多酚-纳米银复合物适量,使用紫外分光光度计对其进行全波长扫描,最终确定紫锥菊多酚溶液最大吸收波长为218 nm,硝酸银溶液无明显吸收,紫锥菊多酚-纳米银复合物最大吸收波长为448 nm。

2.1.2 单因素试验 由图1A可知,按紫锥菊多酚(5 g/L):AgNO3溶液(0.02 mol/L)的体积比为1∶9、3∶7、5∶5制备紫锥菊多酚纳米银复合物,在448 nm处的吸光度随着紫锥菊多酚溶液加入量的增加而增加;当体积比为7∶3、9∶1时,随着紫锥菊多酚溶液加入量增多,吸光度开始下降。由结果可知,最终确定紫锥菊多酚与硝酸银溶液的体积比为3∶7。由图1B可知,硝酸银溶液浓度为0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 mol/L时,紫锥菊多酚-纳米银复合物在448 nm处的吸光度随着硝酸银溶液浓度的降低而降低,最终确定合成工艺中硝酸银的浓度为0.02 mol/L。由图1C可知,紫锥菊多酚-纳米银复合物在448 nm处的吸光度随着反应时间的增加而增加,最终确定合成工艺中反应时间为120 min。由图1D可知,紫锥菊多酚-纳米银复合物在448 nm处的吸光度随着反应温度的升高而增加,最终确定合成工艺中反应时间为100℃。

a.容积比;B.AgNO3浓度;C.反应时间;D.反应温度A.Volume ratio; B.Concentration of AgNO3; C.Incubation time; D.Incubation temperature

2.2 透射电镜

按照最佳工艺获得紫锥菊多酚-纳米银复合物使用透射电子显微镜观察形态,可以看到清晰存在的纳米银。如图2,紫锥菊多酚-纳米银复合物呈现不规则的球形,大部分纳米银直径位于100 nm以下,出现了少量的团聚现象。

图2 紫锥菊多酚-纳米银复合物透射电镜观察

2.3 粒径与Zeta电位

由图3A和B可知,绿色合成法制得的紫锥菊多酚-纳米银复合物平均粒径为118.4 dm,PDI为0.266,结果显示出现2个峰peak1(156.7 dm,97.9%)和peak2(4 265 dm,2.1%);电位为-8.05 mV,表明纳米银复合物达到稳定状态。由图3C可知,化学合成法制得的纳米银平均粒径为110.7 nm,PDI为0.610,结果显示出现2个峰peak1(270.4 nm,79.6%)和peak2(45.4 nm,20.4%)。

A.紫锥菊多酚-纳米银复合物粒径分布;B 紫锥菊多酚-纳米银复合物电位分布;C.化学合成法制备的纳米银粒径分布

2.4 包封率

按照最佳制备工艺制得紫锥菊多酚-纳米银复合物,经离心得到上清液后,经稀释后测定,计算得出包封率为34.7%。

2.5 体外释放率和稳定性

如图4A所示,根据结果绘制药物释放率曲线,药物在0～6 h释放,释放率达到57.19%,在10 h后趋于平缓,在24 h时达到62.20%,说明紫锥菊多酚-纳米银复合物有良好的缓释性能。

a.体外释放率;B.稳定性A.Cumulated release rate in vitro; B.Stability

稳定性试验表明,在4℃条件下,纳米银复合物稳定性较好。如图4B所示,紫锥菊多酚-纳米银复合物从第10天开始,基本达到稳定状态。

3 讨论

本试验通过单因素试验优化紫锥菊多酚-纳米银复合物的制备工艺,最终得到合成过程中的最佳体积比、硝酸银浓度、反应时间和反应温度,并对最佳合成工艺制得的纳米银复合物进行了表征考察,主要包括紫外分光光度计扫描、透射电镜观察、粒径、Zeta电位分析、体外释放率以及稳定性试验。根据紫外分光光度计在300～800 nm处扫描结果可知,绿色合成法制备的纳米银在400～500 nm处出现特征吸收峰,表明纳米银合成。透射电子显微镜观察结果表明,紫锥菊多酚-纳米银复合物呈现不规则的球形,大部分纳米银直径位于100 nm以下,部分复合物发生了团聚。透射电子显微镜可以观察的范围和颗粒数量有限,因此,应用纳米激光粒度仪检测样品的粒径和Zeta电位分布,结果表明,绿色合成法制备的紫锥菊多酚-纳米银复合物与化学合成法制备的纳米银相比,平均粒径差异不大,但分布系数小,粒径分布更加均匀;电位为-8.05 mV,表明纳米银复合物达到稳定状态。体外释放率试验表明,紫锥菊多酚-纳米银复合物有良好的缓释性能。稳定性试验表明,在4℃条件下,纳米银复合物稳定性较好。

本研究通过绿色合成法制备的紫锥菊多酚-纳米银复合物粒径较小,分布均匀,在4℃条件下储存稳定,且体外释放达到了一定的缓释效果。将紫锥菊多酚制成纳米银复合物,改善了其在水中溶解性差的问题,有利于减少投药量,提高药物疗效,为紫锥菊多酚在临床兽医上的使用提供了新的方法。天然产物纳米制剂由于其作用机制独特,不易耐药性和残留,具有绿色、无公害的特点,应用于畜牧养殖业后,可能为养殖户增收、乡村振兴带来具有较大的效益,产生较大的社会价值和经济价值。本研究紫锥菊纳米银复合物采用绿色还原法合成,粒径小,绿色安全,具有较大的研究潜力,有望为绿色发展畜牧业提供新的方向和灵感,在生物医学和制药工业中具有潜在的应用前景,具有进一步研究的价值[18]。