鸡后口吸虫的形态学特征及分子鉴定

包 敏,宋铭忻

(1.东北农业大学动物源性人兽共患病黑龙江省重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;2.锦州医科大学畜牧兽医学院,辽宁锦州 121001)

鸡后口吸虫(PostharmostomumgallinumWitenberg,1923)属于短咽科(Brachylaimidae Stiles et Hassal,1892)后口属(Postharmostomum),寄生于鸡、火鸡、鸽等终末宿主的盲肠,引起后口吸虫病。关于此病仅在广东、福建、上海、江西、四川[1-3]地区有少量报道,而且主要集中在虫体结构的观察。本研究通过对辽宁锦州地区家鸡盲肠中分离的后口吸虫进行形态学观察和DNA提取,分析ITS rDNA序列,为后口吸虫的流行病学调查和分子诊断打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体及虫卵 2023年3月,辽宁省锦州市周边某养殖户送检6只发病的开产蛋鸡,采用寄生虫学剖检法后分别于不同鸡只的双侧盲肠中收集到5～23条数量不等的活虫,经生理盐水冲洗后,进行成虫的形态学鉴定;另取1条活虫在玻璃器皿中剪碎,用手术刀片轻轻挤压虫体,使虫卵从虫体中逸出,用生理盐水反复洗涤后,收集虫卵沉淀物备用;其余虫体于70%乙醇中固定。

1.1.2 主要试剂 Tissue DNA Kit,美国奥美嘉生物技术公司产品;RT-qPCR引物,生工生物工程(上海)股份有限公司产品;ExTaqDNA聚合酶,dNTPs,DL 2 000 DNA Marker,pMD18-T载体,宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 OLYPUS光学显微镜(BX53F),日本奥林巴斯公司产品;PCR扩增仪(System 9700),基因有限公司产品;电泳仪(DYY-12),北京六一科技有限公司产品;天能凝胶成像系统(1600),上海天能科技有限公司产品;蔡司扫描电子显微镜(EVO MA 10),广东省东莞市三本精密有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 成虫及虫卵的光镜观察 肉眼观察虫体的基本形态,将新鲜的虫卵及成虫分别制成玻片标本[4],用光学显微镜和体视显微镜观察,记录虫种的大小、形态、口吸盘、咽、腹吸盘、卵巢、睾丸等器官的特征,根据相关文献记录的形态学要点鉴定虫种。

1.2.2 虫卵的电镜观察 将生理盐水清洗过后的虫卵样本用2.5%戊二醛浸泡过夜,用灭菌纯化水漂洗,3 000 r/min离心5 min,重复3次;取沉淀依次用80%、90%乙醇和无水乙醇脱水各30 min,然后将无水乙醇混悬的虫卵移至直径小于2 cm的圆形载玻片上,待发干后,喷金,扫描电镜下拍照。

1.2.3 rDNA ITS基因序列的PCR扩增及序列分析 取3条虫体和虫卵,分别置于无菌EP管中,利用组织DNA提取试剂盒提取虫体总DNA,提取的DNA样品在-20℃保存备用。以提取的DNA为模板,利用吸虫ITS的通用引物NC5:5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′,NC2:5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′,PCR扩增ITS基因序列。反应体系为 25 μL;反应条件为:92℃ 2 min,92 ℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 1 min 20 s,共35个循环,72℃延伸5 min。扩增结束后,取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检查结果。将电泳结果呈阳性的PCR产物送至北京生工生物技术公司进行双向测序。利用生物学软件DNAStar,将获得吸虫的ITS-2基因序列与NCBI中同源性最高的吸虫ITS序列进行比对分析,以分体属埃及分体吸虫Schistosomahaematobium(KJ137231)和曼氏血吸虫Schistosomamansoni(X153)作为外群,利用Clustal X 1.83 和 MEGA 6.1软件绘制其遗传进化树,探究本吸虫的系统发生位置[5-6]。

2 结果

2.1 成虫的形态学鉴定

虫体未经染色,使用体视显微镜观察玻片标本,显示其形态与文献[7-9]中后口吸虫的描述一致。虫体寄生在宿主的双侧盲肠中,透过盲肠壁的浆膜面可以看到虫体吸附在黏膜面上,盲肠中的全部或部分内容物中混有血液,虫体因吸血而呈黑褐色。虫体无活动性,呈长舌形或鞋底状,体表光滑,体长3.9～9.7 mm、宽1.2～2.3 mm。虫体头端钝圆,从口吸盘开始到末端,两侧宽窄度接近一致,一直到虫体末端两侧向内收紧,逐渐变为圆锥形。

口吸盘、咽、腹吸盘发达,口吸盘位于虫体的前端,明显大于腹吸盘,大小为(0.068～0.093) mm×(0.064～0.081) mm,口孔的直径与咽部的外径大小接近相等,口吸盘的肌肉发达坚实,口吸盘基部肌肉暗黑色、宽阔厚实、外观呈方向盘样。口吸盘下直接与咽部相连接,咽部大小为(0.032～0.046) mm×(0.036～0.047) mm,咽部外观白色,呈水罐形或榛子形,上部宽阔底部逐渐变窄,顶端收紧、开口处连接于与口孔的下端。腹吸盘距离口吸盘和咽部较远,腹吸盘上缘到咽部底端距离约为0.084 mm～0.091 mm。腹吸盘大小为(0.059～0.087) mm×(0.058～0.073) mm,肌肉的发达程度明显不及口吸盘,肌肉外观颜色淡薄。2条盲肠粗大,形成10～12个波浪形的弯曲伸达到虫体的后端,新鲜虫体的肠腔中充满血液,前段呈淡红色,末端为暗红色盲囊状。2个睾丸前后倾斜排列于虫体后2/5处,前睾丸呈椭圆形,大小为(0.055～0.076) mm×(0.044～0.063 )mm,后睾丸呈四方形或长椭圆形,大小为(0.067～0.085) mm×(0.041～0.055 )mm。卵巢呈圆形,位于两个睾丸的对侧,卵巢、两个睾丸三者之间排列形成一个三角形位置关系。卵黄腺十分发达,排列密实紧凑,分布在虫体两侧,左右两侧支的内面与卵巢和睾丸之间紧密相贴,前起于腹吸盘后缘,后止于睾丸与卵巢之间。子宫发达,前方由咽喉中部位置起向后延伸,一直到虫体的后部,腹吸盘为子宫上行支和下行支的分界点,子宫的上行支呈舒展样树枝状,位于咽与腹吸盘之间,下行支呈螺旋样分支状,位于腹吸盘与前面睾丸之间(图1)。观察结果表明本研究分离的吸虫在形态学上鉴定为鸡后口吸虫。

A.口吸盘;B.咽;C.子宫;D.腹吸盘;E.卵黄腺;F.盲肠;G.卵巢;H.睾丸

2.2 虫卵的形态学鉴定

虫卵呈淡黄色,卵壳光滑,体积甚小,一端窄、一端钝圆,芝麻粒状。窄端有一个疣状突起,有一个表面平整的卵盖,卵盖边缘无突起样结构。多数虫卵的卵壳左右两侧不对称,一侧卵壳平整,另一侧卵壳向外突出呈隆起状,隆起处偏于虫卵的钝端。卵壳较厚,表面质地紧密,呈颗粒状,卵内有毛蚴,卵壳与内部结构之间无空隙。虫卵长为30.34 μm±1.71 μm(28.72～34.16 μm),宽为18.54 μm±2.01 μm(15.03～24.64 μm)(图2)。

A.芝麻样外形(400×);B.卵壳表面呈颗粒样(10 000×);C.左右不对称(1 000×);D.宽端(4 000×)

2.3 rDNA ITS基因序列的扩增及分析

利用通用引物扩增3条成虫和虫卵的rDNA ITS基因序列,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,PCR扩增鸡后口吸虫的部分ITS基因序列,4个吸虫阳性PCR产物均成功双向测序,扩增的条带均出现在相同位置,与预期目的片段一致,且无特异性条带(图3)。基因片段经测序后经人工矫正,得到完整的ITS序列,4条虫体的ITS序列基本一致,扩增产物大约为1 646 bp,由于NCBI缺少该吸虫ITS全序列,因此,与Postharmostomumcommutatum(MH915391)的部分ITS序列进行比较,同源性达到99.76%。

M.DNA标准DL 2 000;1～3.成虫DNA的PCR扩增产物;4.虫卵DNA的PCR扩增产物;5.阴性对照

2.4 鸡后口吸虫系统进化分析

利用部分ITS基因作为基因标记构建系统进化树,分体属埃及分体吸虫(Schistosomahaematobium)(KJ137231)和曼氏分体吸虫(Schistosomamansoni)(X153)作为外群,选择异双盘属(Leucochloridium)的4个虫体ITS序列与本研究的鸡后口吸虫的部分ITS序列一起构建进化树,结果显示,包括本研究在内的后口属吸虫(Postharmostomum)形成独立的一个分支,支持率达到100%,符合该属的独特地位,异双盘属(Leucochloridium)的4个吸虫聚集在另一个大分支内,双盘属与后口属吸虫均为短咽科(Brachylaima)(图4)。

图4 后口吸虫的系统进化树

3 讨论

吸虫病需要有软体动物参与才能完成生活史,后口吸虫属于短咽科,以陆地螺等作为中间宿主[10],在放养过程中家鸡喜好啄食地面的软体动物、昆虫等[11],此过程正好将感染了吸虫幼虫的陆地螺吞食体内,螺体内的幼虫进入鸡体继续其发育过程,造成感染,因此,散养鸡感染吸虫病比较普遍[12]。后口吸虫在盲肠中寄生,依靠口吸盘、腹吸盘附着在肠黏膜上蠕动和移行,一方面,吸盘机械性刺激、损伤肠黏膜,引起出血性肠炎,肉眼观盲肠黏膜肿胀、盲肠尖和盲肠体呈弥漫性出血;另一方面,虫体夺取宿主的血液和肠上皮细胞,肠腔中堆积的大量血液、虫体的代谢产物与盲肠内容物混合在一起,影响了盲肠正常的消化吸收功能,鸡出现贫血、消瘦等消耗性症状和病变,在继发和混合感染或有其他应激因素存在时出现死亡。因此,在重视鸡饲养管理的同时,应该关注为鸡定期驱虫[13]。

短咽科吸虫寄生在禽类和哺乳类的肠道以及禽类的腔上囊,该科吸虫的相关描述尚不完整,此外,短咽科的分子方面研究极少。本次发现的后口吸虫虫卵在光镜下观察的结果为芝麻形,与陈克强报道的椭圆形有所不同[14]。本次研究最终确定所分离的吸虫为鸡后口吸虫,为辽宁省首次报道,该结果为鸡消化道蠕虫流行病学调查及短咽科吸虫分子鉴别诊断提供了科学依据。