体外抗猪轮状病毒8种藏药的初步筛选

豆 薇,赵 龙,郝 峰,吕长荣,王 栋,陈 晨,高海慧,韩生义,顾庆云,李生庆*,郭抗抗*

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌712100;2.青海省畜牧兽医科学院,青海西宁 810016;3.西藏职业技术学院 西藏兽药重点实验室,西藏拉萨 850030)

藏药是发源于青藏高原的古老民族药,药物种类繁多,资源丰富,作为中国传统医药学的重要组成部分,我国对藏药的开发和使用在长期与疾病斗争中积累了丰富的经验[1-2]。早在2 000多年前就因其独特的理论和疗效而著名[3],成为仅次于中医药而有系统理论的民族医药。临床实践证明藏药在预防和治疗病毒性疾病方面具有明显的作用,在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)、严重急性呼吸综合征(SARS)、禽流感等传染性疾病防治中有一定的作用[4-5]。研究表明,藏药诃子提取物对单纯疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)等病毒具有较好地抑制作用[6],对多种致病性革兰氏阳性(G+)和革兰氏阴性(G-)细菌具有广谱抗菌作用[7],也是目前防治COVID-19藏药复方中使用频数最多的药物。甘青乌头提取物可有效抑制单纯疱疹病毒(HSV-2)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)活性[8-10]。矮紫堇水提物对BVDV有较好的体外抑制作用,同时也具有抗菌消炎的作用。研究发现,多种藏药对病毒和细菌均有显著的抑制活性,对其进行成分鉴定和深入研究是开发新型抗菌、抗病毒天然药物的一个重要来源[11-15]。

本课题组近年来开展抗病毒天然产物的筛选和机制研究,对数十种的藏药水提物抗病毒作用进行了研究,初步筛选到了具有潜在抗病毒作用的8种藏药,为后续研究提供了基础材料。本研究以猪轮状病毒为靶标病原,对筛选到的8种藏药水提物的体外抗病毒作用进行了初步研究,以期为抗病毒藏药的筛选、成分鉴定及作用机制研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 诃子(TerminaliachebulaRetz.)、甘青乌头(AconitumtanguticumMaxim.)、矮紫堇(CorydalisedulisMaxim.)、甘青青兰(DracocephalumtanguticumMaxim.)、川西獐牙菜(SwertiamussotiiFranch.)、短穗兔耳草(LagotisbrachystachyaMaxim.)、铁棒锤(AconitumpendulumBusch.)、瑞香狼毒(StellerachamaejasmeLinn.)等,西藏自治区拉萨市堆龙云森生物公司产品;利巴韦林标准品(货号:SR8570),索莱宝公司产品。

1.1.2 细胞与病毒 恒河猴肾细胞传代细胞系(MA-104)由本实验室保存;猪轮状病毒(PoRV)G9P[23]型毒株由西北农林科技大学动物医学院兽医公共卫生与畜禽产品安全实验室(本实验室)分离鉴定和保存,按Reed-Muech氏法计算PoRV的TCID50为10-6.02/0.1 mL。

1.1.3 主要试剂 CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒,米鼠生物科技公司产品;EvoM-MLV反转录预混型试剂盒、SYBR®GreenProTaqHS预混型qPCR试剂盒,AG艾科瑞生物科技有限公司产品;4%多聚甲醛、DAPI溶液,北京索莱宝科技有限公司产品;Triton X-100穿透液、TPCK胰酶,Sigma有限公司产品;兔抗PoRV多克隆抗体由本实验室制备;CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),Proteintech Group产品;胎牛血清,依科赛生物科技公司产品;DMEM培养基、0.25%-EDTA-胰酶,Cytiva公司产品;其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.4 主要仪器 酶标仪(Multiskan FC),美国Thermo公司产品;倒置荧光显微镜(Axio Observer),德国ZEISS公司产品;荧光定量PCR仪(CFX Connect),美国Bio-Rad公司产品;高速离心机(Centrifuge 5417R),德国Eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 藏药水提取物的制备 分别将诃子、甘青乌头、矮紫堇、甘青青兰、川西獐牙菜、短穗兔耳草、铁棒锤、瑞香狼毒等8种藏药用去离子水洗净杂质后置于55℃烘箱中烘干,备用。分别称取单个藏药50 g,剪切至长度约1 cm左右,加入500 mL去离子水于4℃浸泡12 h,转入砂锅中大火煮沸,然后用文火煎煮1 h,用8层纱布过滤,将滤液于烧杯中收集,将滤渣中加入500 mL去离子水再次煎煮1 h并过滤,此操作重复2次,将3次煎煮所得滤液合并,5 000 r/min离心10 min,取上清液于60℃水浴中浓缩,真空干燥制成干粉后密封,4℃避光保存。

1.2.2 药物稀释 根据各种藏药水提物干燥粉末的黏稠度,选择适量体积无血清DMEM培养液对8种藏药提取物粉末进行溶解,以此为原始浓度进行2倍梯度稀释。取100 mg利巴韦林标准品加入1 mL无血清DMEM培养液溶解制成原始浓度药液,然后进行2倍梯度稀释。稀释后的药液经0.22 μm滤器过滤,4℃避光保存备用。

1.2.3 药物对MA-104细胞最大安全浓度测定 细胞按照每孔约1×105个/mL的密度接种于96孔板,生长至单层细胞后加入2倍梯度稀释后的药物,各药物的稀释梯度为2-1～2-20,每孔100 μL,每个稀释度设8个复孔,同时设立正常细胞和无细胞对照,待致细胞病变效应(CPE)不再继续时,用Hank＇s液洗涤96孔板3次,每孔加入10 μL CCK-8试剂后将96孔板在细胞培养箱(37℃、5% CO2)中继续培养2 h,用酶标仪测定波长为450 nm处OD值,根据公式计算细胞的存活率。

细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%,As为加药组OD值,Ab为无细胞组OD值,Ac为无药组OD值。最大安全浓度(MNTC)是能够使90%以上的细胞存活的药物浓度。以MNTC为基准,继续进行5个梯度的2倍梯度稀释,用于后续试验。

1.2.4 药物对猪轮状病毒致细胞病变作用的影响 将含有200 TCID50PoRV病毒液分别与8种药物稀释液等体积混合,每种药物以安全浓度为基准各进行5个梯度稀释(20～2-4),置于细胞培养箱中作用2 h,然后将病毒—药物稀释液混合物加入96孔板中的MA-104细胞上(80%细胞密度)[16],每个浓度设8个复孔,每孔加入100 μL混合物,细胞培养箱中孵育2 h,弃上清液,每孔加入100 μL细胞维持液继续培养,12、24、36、48、72 h后观察每孔的CPE情况。同时设置正常细胞对照组、病毒对照组(DMEM代替药物)和空白对照组,继续培养72 h后按1.2.3操作进行CCK-8细胞活力检测,并计算药物对PoRV引起细胞病变的抑制率。

抑制率(%)=[(试验加药组平均OD值-病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值)]×100%。

1.2.5 药物对猪轮状病毒复制的影响 用实时荧光定量PCR检测PoRV mRNA相对表达量,评价药物对病毒复制的影响。将等体积的200 TCID50PoRV病毒液与对PoRV最大抑制率超过50%的5种药物稀释液混合均匀,各药物浓度均为最大安全浓度,置于细胞培养箱中作用2 h后,将病毒-药物稀释液混合物加入12孔板中的MA-104细胞上(80%细胞密度),每个浓度设3个复孔,每孔500 μL混合物,置于细胞培养箱中孵育2 h,弃上清液,每孔加1 mL细胞维持液继续培养36 h后收取样本。同时设置正常细胞对照组、病毒对照组(DMEM代替药物)。各组细胞样本均使用Trizol法进行总RNA提取,然后立即使用Evo M-MLV反转录预混型试剂盒合成cDNA。按照本实验室前期设计的VP6基因的引物进行检测[17],以β-actin作为内参基因。β-actin引物序列为:上游引物F(GCCAACCGTGAGAAGATGAC),下游引物R(AGGCATACAGGGACAGCACA)。引物序列由西安擎科生物科技有限公司合成,引物使用浓度为10 μmol/L。结果使用 2-ΔΔCt方法计算 mRNA 的相对表达量,并用GraphPad软件进行统计学差异性分析。

1.2.6 药物对猪轮状病毒复制增殖的影响 间接免疫荧光技术检测PoRV蛋白表达,评价药物对病毒复制增殖的影响。将等体积的200 TCID50PoRV病毒液与对PoRV最大抑制率超过50%的5种药物稀释液混合均匀,各药物浓度均为最大安全浓度,置于细胞培养箱中作用2 h后,将病毒-药物稀释液混合物加入12孔板中的MA-104细胞上(80%细胞密度),每个浓度设3个复孔,每孔500 μL混合物,置于细胞培养箱中孵育2 h,弃上清液,每孔加1 mL细胞维持液继续培养36 h后收取样本。同时设置正常细胞对照组、病毒对照组(DMEM代替药物)。

将处理的各组细胞样本用PBS洗涤3次,用4%多聚甲醛固定细胞25 min;用PBS洗涤3次后,加入穿透液(1% Trition)室温下作用15 min;PBS洗涤3次后,加入5%脱脂奶粉,37℃封闭1 h;PBS洗涤后,加入1∶100稀释的兔抗PoRV多克隆抗体,室温作用1 h;PBS洗涤3次;用1∶500稀释的CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) 抗体室温孵育1 h;PBS洗涤3次后,用DAPI染核8 min;PBS洗涤3次,置倒置荧光显微镜观察荧光强度。

2 结果

2.1 药物稀释浓度

将8种藏药利用水提法提取并烘干成粉保存备用。表1为各藏药和利巴韦林药物的原始稀释浓度,诃子、甘青乌头、甘青青兰、短穗兔耳草、川西獐牙菜、铁棒锤、瑞香狼毒、矮紫堇和利巴韦林的原始稀释浓度分别为500.0、500.0、500.0、333.3、250.0、250.0、166.7、500.0、100.0 mg/mL。

表1 药物原始稀释浓度

2.2 藏药水提物对MA-104细胞的最大安全浓度

药物作用细胞后在显微镜下观察得知,随药物浓度的不断扩大,试验加药组表现出不同程度的细胞病变,细胞逐渐皱缩变圆、出现胞质空泡化、细胞脱落聚集成簇等病理变化。诃子、甘青乌头、甘青青兰、短穗兔耳草、川西獐牙菜、铁棒锤、瑞香狼毒、矮紫堇和利巴韦林的稀释浓度分别在0.02、0.49、0.98、2.60、7.81、15.63、1.30、31.25、0.20 mg/mL之内时的细胞形态与正常细胞对照组相比基本一致。因此,将该浓度判定为各药物对MA-104细胞的最大安全浓度,如表2所示。

表2 药物的最大安全浓度

2.3 药物对猪轮状病毒致细胞病变作用观察

在药物与PoRV混合处理2 h后,对照组细胞拉丝呈网格状病变,呈现CPE。而诃子、短穗兔耳草、川西獐牙菜、铁棒锤、瑞香狼毒5种藏药水提物组及利巴韦林药物组在安全浓度下可显著减轻CPE,未出现典型的细胞网格状现象(图1)。对PoRV致细胞病变的最大抑制率分别为63.74%、86.19%、87.37%、91.88%、91.55%、96.33%。甘青乌头、甘青青兰和矮紫堇提取物对PoRV致细胞病变的最大抑制率均低于20%(图2)。在安全浓度范围内,8种藏药提取物对PoRV的抑制率呈一定的量效关系(表3)。

a.PoRV阳性;b.阴性;c.川西獐牙菜;d.利巴韦林a.PoRV positive; b.control; c.Swertia mussotii; d.Ribavirin

表3 藏药对PoRV的有效抑制率

2.4 实时荧光定量PCR检测结果

5种藏药水提物对PoRV在细胞中mRNA相对表达量的影响见图3,在药物与PoRV处理2 h后,川西獐牙菜、瑞香狼毒、短穗兔耳草、铁棒锤、诃子5种藏药组和利巴韦林用药组细胞的PoRV mRNA相对表达量显著低于阳性对照组细胞。各用药组与阳性对照组相比差异极显著(P<0.001),表明5种藏药提取物和利巴韦林药物能有效抑制PoRV的复制。

a.PoRV;b.PoRV+诃子;c.PoRV+铁棒锤;d.PoRV+短穗兔耳草;e.PoRV+川西獐牙菜 ;f.PoRV+瑞香狼毒;g.PoRV+利巴韦林.P<0.05(*),P<0.01(**),P<0.001(***)a.PoRV;b.PoRV+Terminalia chebula; c.PoRV+Aconitum pendulum; d.PoRV+Lagotis brachystachya; e.PoRV+Swertia mussotii; f.PoRV+Stellera chamaejasme; g.PoRV+Ribavirin;P<0.05 (*),P<0.01 (**),P<0.001 (***)

2.5 间接免疫荧光试验结果

间接免疫荧光结果显示感染组PoRV特异性绿色荧光最多,表明PoRV感染了大多数MA-104细胞,用药组绿色荧光明显减少(图4),提示诃子、铁棒锤、短穗兔耳草、川西獐牙菜、瑞香狼毒5种藏药水提物和利巴韦林能有效抑制PoRV感染,对PoRV具有抑制作用。

图4 间接免疫荧光试验观察药物对PoRV感染的抑制作用

3 讨论

PoRV属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,是引起仔猪腹泻的重要肠道病原之一,主要造成感染仔猪厌食、呕吐、腹泻、水样粪便等, 严重者甚至导致仔猪死亡[18]。PoRV在我国全国范围内均有流行,具有高发病率和病死率的特征。该病毒主要存在于患病和带毒猪的消化道,随粪便排到外界环境后,污染饲料、饮水、垫草及土壤等,经消化道途径使易感猪感染[19-20]。由于PoRV与其他引起肠道症状的病毒感染临床症状相似,在实际生产中通常被忽略,而延误最佳防控时间,导致大量仔猪死亡,给养殖业造成严重的经济损失。目前对于PoRV无特效的治疗药物,临床中常采用疫苗进行防控,而传统疫苗存在免疫失效和交叉保护性差等问题[21]。因此,筛选和研制抗病毒药物显得尤为重要[22-23]。

为筛选出有抗病毒作用的中药,本课题组从藏药入手以PoRV为靶标病原进行抗病毒天然产物的筛选和研究。本研究采用药物与病毒预先作用的方式进行体外抗病毒试验。CCK-8试验结果显示,藏药诃子、铁棒锤、短穗兔耳草、川西獐牙菜、瑞香狼毒提取物及利巴韦林药物对PoRV有较高的抑制率,最大抑制率均大于50%,能有效减轻细胞病变效应。实时荧光定量PCR结果显示,5种藏药提取物和利巴韦林药物与阳性对照组相比可显著降低PoRV mRNA的相对表达量,抑制PoRV的复制增殖。间接免疫荧光结果显示,5种藏药提取物和利巴韦林药物与阳性对照组相比PoRV特异性绿色荧光明显减少,能有效抑制PoRV的感染,与实时荧光定量PCR结果相符。对3个试验结果进行分析,推测5种藏药提取物在体外对PoRV存在直接杀伤作用,药物可能影响病毒表面抗原或受体的表达,进而影响病毒的黏附和入侵,使细胞病变减轻,起到抗病毒作用[18]。目前对5种藏药提取物的抗病毒作用机制尚不明确,仍需进一步研究。本研究结果与李晓惠和韵海霞等[24-25]报道的藏药具有抗病毒作用的结果基本相符,进一步表明5种藏药提取物对PoRV均存在一定的抗病毒作用,研究结果为藏药的开发利用提供了参考。

综上所述,本研究成功从8种藏药水提物中筛选出诃子、铁棒锤、短穗兔耳草、川西獐牙菜、瑞香狼毒5种藏药水提物,具有一定的体外抗猪轮状病毒作用。