标本离心时间对凝聚胺介质法抗体筛检试验的影响

尹红怡，刘 静，刘乐霞，张 露，刘井东

（河北省沧州中西医结合医院，河北 沧州 061001）

不规则抗体筛查在目前的临床实践中已经得到广泛应用，常用的方法有凝聚胺法、经典抗人球蛋白法和微柱凝胶法。其中凝聚胺技术（MPT）因其快速、灵敏、简便、准确等特点在临床检验工作中被经常使用。在日常血清学试验中，加入凝聚胺试剂（Polybrene 溶液）后离心可使红细胞产生非特异性凝集，此种凝集是可逆的，再加入重悬液（Resuspending 液），若标本存在不规则抗体时则凝集不散开，则表明不规则抗体筛查试验结果为阳性；若标本存在不规则抗体则凝集散开，则表明不规则抗体筛查试验结果为阴性[1]。本研究采用凝聚胺技术，使用EDTA-2K 抗凝采血管采血，按照贝索凝聚胺介质试剂说明书操作，将变量定为离心时间，试验结果观察时间为2 min，本研究设计了5 组试验，结果发现凝聚胺试验的阳性检出率不同，凝集强度也存在差异，详细报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究采集本院2020 年7 月至2023 年6 月年龄段在16 ～72 岁的患者标本，共计7128 例标本。对所有标本均进行不规则抗体筛查试验，使用微柱凝胶法和凝聚胺法检测，凝聚胺法用显微镜复核结果。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器

凝聚胺介质试剂（BASO）、抗体筛选红细胞试剂盒（上海血液中心）、人不规则抗体检测用3%红细胞试剂盒（奥森多）、血型试剂质控试剂盒（上海血液中心）、一次性使用试管（KANGJIAN）、单道可调移液器（大龙）、医用离心机BASO2020-2、医用离心机BY-320A（北京白洋）、抗人球蛋白（IgG）检测卡（奥森多）、全自动血型分析系统VISIONMax（奥森多）、光学显微镜（OLYMPUS-CX33）。

1.2.2 检测方法

获取血样后，采用医用离心机BY-320A 在室温下以3000 r/min 转速离心3 min 待用。凝聚胺法：（1）取试管三支，共5 组，各加入被检血浆2 滴，分别加入3%～5%筛检红细胞各1 滴。（2）用移液器各加LIM 0.65 mL 混匀，再各加Polybrene 溶液2 滴，混匀。（3）用BASO离心机以3400 r/min 转速（相当于1000 g 离心力）离心，分别离心10 s、20 s、30 s、45 s、120 s，然后倒掉上清液，不沥干，使管底残留0.1 mL 液体。（4）轻摇试管，目测红细胞是否凝集，如无凝集，则需重做。（5）最后加入Resuspending 液2 滴，轻摇试管使红细胞混合并观察结果。微柱凝胶法：严格按照全自动血液分析系统的检测说明书，规范进行上机操作，检测不规则抗体。

1.3 判断标准

凝聚胺法阳性结果：凝集不散开，仍出现颗粒性或块状凝集，是红细胞抗原抗体结合的特异性反应，其中4+为红细胞凝集成一大块，背景清晰；3+为红细胞凝集成数个小块，背景尚清晰；2+为红细胞凝块分散成数个小块，背景可见游离红细胞；1+为肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞。镜下阳性：凝集散开，滴入玻片用光学显微镜观察是否凝集，镜下聚集成团状，是红细胞抗原抗体结合的特异性反应；阴性结果：凝集散开，滴入玻片用光学显微镜观察是否凝集，镜下不凝集表示由Polybrene 溶液引起的非特异性凝集。详见图1。质控措施：试验操作的标准化，确保试验操作步骤的一致性，包括试剂的准备、滴加顺序和数量、观察时间点等。对照试验：使用已知阳性和阴性样本进行对照，以验证试验过程的有效性和可靠性。重复性：对关键样本进行重复试验，以确保结果的一致性和可重复性。显微镜校准：确保显微镜的清晰度和放大倍数准确，以便准确观察红细胞的凝集情况。记录和报告：详细记录试验观察结果，并在报告中明确指出凝集的程度和评级。微柱凝胶法：以全自动血型分析系统判别，并经人工审核结果。

图1 凝聚胺法结果判定图

1.4 观察指标

检测后，比较凝聚胺法不同离心时间的阳性检出率和凝集强度。比较微柱凝胶法与凝聚胺法的检测结果。

1.5 统计学方法

采用IBM SPSS 22.0 软件对本文数据进行统计学分析。不规则抗体灵敏度、结果的阳性率用例数和%表示，采用卡方（χ2）检验，计量资料用±s表示，采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 凝聚胺法不同离心时间的检测结果分析

在5 组不同时间的凝聚胺试验中，离心时间10 s 时，阳性检出率77.6%（66/85），20 s 时，阳性检出率80.0%（68/85），30 s 时，阳性检出率89.4%（76/85），45 s 时，阳性检出率84.7%（72/85），120 s 时，阳性检出率85.9%（73/85），其中χ2值为4.391，P值为0.036。详见表1。

表1 凝聚胺法不同离心时间阳性率比较[%（例）]

2.2 抗-E 和抗-D 不同离心时间后强度比较

在血型试剂质控试剂盒的抗体凝集强度检测时，其中抗-D 的凝集强度和20 s 组、30 s 组、45 s 组结果一致，低于120 s 组的结果；而10 s 组抗-E 的凝集强度是-，20 s 组的凝集强度是+（用光学显微镜观察结果），直到30 s 组之后三组的凝集强度可以用肉眼直接观察到明显的凝集，强度达到++。详见表2。由此可见，10 s 的离心时间不能满足临床试验需要。

2.3 血浆微柱凝胶法与凝聚胺法检测结果对比

检测后经对比可知，微柱凝胶法阳性例数82 例，凝聚胺法综合阳性例数76 例，由表3 计算可知，两种方法的真阳性率（灵敏度）对比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 血浆微柱凝胶法与凝聚胺法检测结果对比[%（例）]

3 讨论

为保证输血安全，临床需要在输血前进行血型检测、不规则抗体筛查、交叉配血试验，其结果越准确越能减少输血不良反应的发生[2]。凝聚胺法操作简单，灵敏度高，试验时间短，这是它的优点。本研究中120 s 组的阳性检出率和凝集强度虽然更高，但耗时长，不利于发挥凝聚胺法的优点；30 s 组和45 s 组阳性率也相对较高，一些较弱的凝集亦能检测出来，不容易漏检不规则抗体，耗时短，提高了试验的特异性和检出率，能有效提高输血治疗的安全性[3]。微柱凝胶法操作简单，不易受人工因素影响，阳性检出率高，结果可以长期保持，易于自动化操作，是较为理想的不规则抗体检测方法[4]。我们运用血清学的方法检测不规则抗体，实际是对特定抗原抗体的检测，通常以凝集强度作为判断的指标，在IgG 类抗体中，除部分抗体如IgG 抗-A、抗-B、抗-D、抗-M等外，大多数的IgG 类抗体不能使红细胞出现肉眼可见的凝集，这时候就需要在试验中加入某种介质[5]。通常临床实验室使用的方法有凝聚胺法和微柱凝胶法，经典抗人球蛋白法操作繁琐，易受到实验者的影响，在这里不做研究。凝聚胺是一种高价阳离子季铵盐多聚物，它溶解后产生的正电荷可以中和红细胞膜表面的唾液酸所产生的负电荷，缩短红细胞间距，使红细胞产生非特异性凝集[6]。这种非特异性凝集是可逆的，若没有不规则抗体存在，则在加入重悬液后凝集消失；若标本中存在不规则抗体，则凝集不消失。微柱凝胶法是将试验需要用到的标准稀释液制作成凝胶，采用微观柱作为容器灌注，使红细胞凝胶颗粒分子过滤，这样凝集的红细胞便被保留在了微柱中，操作者可通过肉眼读取凝集结果[7]。

分析凝聚胺法和微柱凝胶法可以发现，微柱凝胶法阳性检出率高于凝聚胺法，且灵敏度也高于凝聚胺法，同时这两种检测方法都存在假阳性。凝聚胺法容易受到冷凝集素、肝素、试剂存放时间的影响，本次研究均使用EDTA采血管，但如果患者使用了肝素治疗，依然可能对试验结果造成影响[8]。而微柱凝胶法容易受到蛋白凝集和血小板聚集的影响，在交叉配血试验中血小板聚集会造成假阳性，如果受到蛋白凝集的影响，可以在试验过程中使用生理盐水稀释血浆后再进行检测，以减少假阳性的出现[9]。

医务人员要在临床工作中做好输血前的筛查试验，不同情况下采用不同的检测方法以保证试验的安全性和时效性。如对于急诊需要紧急输血的患者，使用微柱凝胶法进行交叉配血和抗体筛查，虽然其阳性检出率更高，但时间过长。这时简便快速又有效的凝聚胺法就是更好的选择。对于通过输血来改善贫血的患者来说，有充足的时间可以进行临床检验，这时微柱凝胶法和凝聚胺法均可采用。对于需要输血的儿童，因其ABO 及Lewis 等血型系统未发育完全，故在使用凝聚胺法检测时应延长离心时间。一些血液病患者、长期输血患者、多次妊娠者更易产生不规则抗体，尤其在抗原或抗体较弱时，这种情况下进行抗体筛查时用微柱凝胶法的检出阳性率更高，而使用凝聚胺法检测时应延长离心时间。但对于多发性骨髓瘤（MM）患者，使用CD38 单抗进行治疗时，生理盐水稀释不能消除微柱凝胶法的假阳性结果，需要进行二硫苏糖醇处理。但此法耗时长，易发生溶血，临床实验室应用效果不佳。凝聚胺法能够不受MM 治疗药物和本身蛋白凝集的影响，是较为理想的检测方法[10]。

综上所述，凝聚胺法在临床输血治疗中是不可或缺的方法之一，其操作便捷、有较高的灵敏度，临床工作中应根据实际情况选择合适的检测方法[11-12]。而改良试验反应时的离心时间达到30 s 或45 s，在本次研究的不规则抗体筛查试验中，能提高凝聚胺法的阳性检出率，有利于提高临床输血的安全性。至于相关的交叉配血试验，推测也能提高其阳性检出率，但缺乏进一步研究试验。