HPLC法测定小儿肺热咳喘口服液中3种防腐剂的含量

李兵兰 王娟 何奕熹

【摘 要】 目的：建立小儿肺热咳喘口服液中3种防腐剂苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量测定方法。方法：采用高效液相色谱法（HPLC），色谱柱为Thermo syncronis C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81），流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长320 nm，进样量10 μL。结果：苯甲酸、山梨酸、糖精钠在5～60 μg/mL范围内与其峰面积均呈良好的线性关系（r>0.999），平均加样回收率分别为99.72%（RSD=1.57%，n=6），97.30%（RSD=1.70%，n=6），101.37%（RSD=0.99%，n=6）；苯甲酸、山梨酸、糖精钠精密度试验的RSD分别为0.07%、0.21%、0.18%。结论：实验采用的HPLC法简便、准确、专属性强、重复性好，可用于液体口服制剂中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量测定。

【关键词】 小儿肺热咳喘口服液；苯甲酸；山梨酸；糖精钠；高效液相色谱法；含量测定

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2024）03-0037-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.03.zgmzmjyyzz202403009

Determination of 3 Preservatives in Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution by HPLC

LI Binglan WANG Juan HE Yixi

Honghe Institute for Food and Drug Control，  Mengzi 661199， China

Abstract：Objective To establish a method for the determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution.Methods The determination by high performance liquid chromatography（HPLC） was performed on Thermo syncronis C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）with mobile phase consisted of acetonitrile-0.2% phosphoric acid（19∶81，V/V）at the flow rate of 1 mL/min; the detection wave length was set at 320 nm， and sample size was 10 μL; the column temperature was 30 ℃.Results The linear range of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium were 5-60 μg/mL（r>0.999）. The average recovery rate was 99.72%， 97.30% and 101.37%. and RSD were 1.57%， 1.70% and 0.99%（n=6）. The RSD of precision test were 0.07%， 0.21% and 0.18%. Conclusion The HPLC method is simple， accurate， specific and repeatable which could be used for the determination of benzoic acid， sorbic acid and saccharin sodium in Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution.

Keywords：Xiaoer Feire Kechuan Oral Solution; Benzoic Acid; Sorbic Acid; Saccharin Sodium; HPLC; Content Determination

小兒肺热咳喘口服液收载于2020版《中国药典》一部，是由麻黄、苦杏仁、石膏、甘草、金银花、连翘、知母、黄芩、板蓝根、麦冬、鱼腥草等十一味中药组成，具有清热解毒、宣肺化痰的功效，常用于小儿热邪犯肺所致发热、咳嗽等^［1］。苯甲酸、山梨酸、糖精钠是常见的防腐剂，在中药口服液中添加防腐剂可以起到防止微生物污染的作用^［2-3］。但添加过量的防腐剂会对人体产生毒副作用，文献报道^［4-5］苯甲酸能诱发相关性水肿和急性荨麻疹，苯甲酸与糖精钠对细胞的毒性作用均表现为相加作用，中国药典明确规定苯甲酸和山梨酸用于中药合剂（口服液）中的用量不得超过0.3%（其钾盐、钠盐的用量分别按酸计）^［6］，尚无根据不同口服液体制剂制定不同防腐剂添加量的标准。为了严格控制防腐剂地使用，保证用药安全，本文探索了小儿肺热咳喘口服液中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的HPLC测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司，G1311C四元泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G1314B紫外检测器）。

1.2 试药 乙腈为色谱纯，厂家为赛默飞世尔科技（中国）有限公司；磷酸为分析纯，厂家为天津市风船化学试剂科技有限公司；水为超纯水。苯甲酸溶液标准物质（批号：21001；含量：1.00 mg/mL）、山梨酸溶液标准物质（批号：21001；含量：1.00 mg/mL）、糖精钠溶液标准物质（批号：19001；含量：1.00 mg/mL）均购自中国计量科学研究院；小儿肺热咳喘口服液14个批号均来自同一厂家，批号分别为202111020、202103011、202112059、202101107、202001036、202106003、202101107、202111079、202103075、202101106、202107021、202107012、202112059、202112116，规格为每1 mL相当于饮1.77 g，样品来源为省级评价性抽样。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：样品经处理后采用HPLC法，色谱柱为Thermo syncronis C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81）；流速：1 mL/min；检测波长230 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 标准溶液的制备 精密量取苯甲酸溶液标准物质、山梨酸溶液标准物质、糖精钠溶液标准物质各2 mL，置20 mL容量瓶中，加5%甲醇溶液溶解并定容，混匀，制成浓度为100 μg/mL的标准溶液，作为标准储备液1。精密量取1 mL标准储备液1至5 mL容量瓶中，加5%甲醇溶液溶解并定容，混匀，作为标准溶液。精密量取苯甲酸溶液标准物质、山梨酸溶液标准物质、糖精钠溶液标准物质各3 mL，置20 mL棕色容量瓶中，加5%甲醇溶解并定容，混匀，制成浓度为150 μg/mL的标准溶液，作为标准储备液2，用于回收率试验。精密量取1 mL标准储备液1至5 mL容量瓶中，加5%甲醇溶液溶解并定容，作为标准溶液（20 μg/mL）。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取样品1 mL，置100 mL容量瓶中，加入5%甲醇溶液稀释至刻度，混匀，作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液制备 按小儿肺热咳喘口服液处方比例和制备工艺自制不含防腐剂的小儿肺热咳喘口服溶液作为阴性对照溶液。

2.5 专属性考察 分别取标准溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”色谱条件进样，记录色谱图，结果如图1所示，待测成分与其他物质分离良好，分离度均大于1.5，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的理论板数分别为22216、22190、20325。阴性对照溶液色谱图在待测成分相应位置无干扰峰，表明其它成分对待测成分的测定无干扰。

2.6 线性关系考察 精密量取标准储备液1（100μg/mL）0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、4 mL、6 mL分别置于10 mL容量瓶中，加5%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。按“2.1”项下色谱条件分别进样，测定峰面积。分别以苯甲酸、山梨酸、糖精钠溶液浓度（μg/mL）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程，结果表明苯甲酸、山梨酸、糖精钠在5～60 μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系。如图2所示、见表1。

2.7 精密度试验 取标准溶液（20 μg/mL），按“2.1”项下色谱条件，重复进样6次，测定峰面积。结果苯甲酸、山梨酸、糖精钠的苯甲酸峰面积RSD分别为为0.07%（n=6）、0.21%（n=6）、0.18%（n=6），表明仪器的精密度良好。

2.8 稳定性试验 取批号为202111020的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h，32 h、36 h各进样1次，测定峰面积。结果苯甲酸峰RSD为0.52%（n=13），表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取批号为202111020的供试品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样测定。结果苯甲酸的平均含量为2.4848 mg/mL，RSD为0.46%（n=6），表明方法的重复性良好。

2.10 回收率试验 分别精密量取5 mL批号为202111020的供试品6份置于100容量瓶，加入5%甲醇溶液稀释至刻度，作为供试品溶液，分别量取上述供试品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，分别加入1 mL标准储备液2，加入5%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀。将处理好的供试品溶液按上述色谱条件测定，计算回收率，苯甲酸、山梨酸、糖精钠的平均回收率分别为99.72%（RSD=1.57%，n=6），97.30%（RSD=1.70%，n=6），101.37%（RSD=0.99%，n=6）。结果见表2。

2.11 样品含量测定 取14批小儿肺热咳喘口服液样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠的含量。含量测定结果见表3。

3 讨论

考察甲醇-0.15%乙酸铵溶液对苯甲酸、山梨酸、糖精钠的分离效果^［7］，发现苯甲酸峰不能与相邻峰完全分离，而使用乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81）苯甲酸峰能与相邻峰有较好分离度，且峰型较好，因此本方法采用乙腈-0.2%磷酸溶液（19∶81）作为流动相。苯甲酸微溶于水，易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，考察5%甲醇溶液、10%甲醇溶液作为稀释溶剂，5%甲醇溶液、10%甲醇溶液溶解的样品稳定性均良好，但是随着甲醇浓度的增大，溶解样品的过程中会产生沉淀，所以本法采用5%甲醇溶液做为溶剂。

文献报道^［4］苯甲酸钠使荨麻疹及新生儿高胆红素血症的风险增加，特别是有高胆红素血症、多动症的新生儿或儿童应谨慎使用。从检验结果看，14批小儿肺热咳喘口服液的苯甲酸含量为0.24%～0.25%，山梨酸、糖精钠均未检出，均在中国药典规定的限度范围内，说明防腐剂苯甲酸、山梨酸、糖精钠项目厂家严格按照药典标准投料。本方法可以在30 min内测定其含量，方法灵敏、准确、稳定，为其含量的分析提供了理想的方法，可以用于防腐剂投料的监控。研究中药小儿口服液体制剂的防腐剂投入量，尽量减少防腐剂使用量，提高儿童制剂的安全性。

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2020：565-566.

［2］袁媛，钟水生，张华锋，等.HPLC法同时测定小儿咳喘灵口服液中7中防腐剂的含量［J］.中国药师，2020，23（12）：2473-2476.

［3］龙凯，王娟.高效液相色谱法测定治咳川贝枇杷露中苯甲酸、羟苯乙酯含量［J］.中国民族民间医药，2021，30（6）：43-45.

［4］秦辉，王娜，王宾，等.中成药中的辅料使用报告评价与不良反应分析［J］.海峡药学，2021，33（2）：214-216.

［5］王思文，巩江，高昂，等.防腐剂苯甲酸的药理及毒理学研究［J］.安徽农业科学，2010，38（30）：16845-16846.

［6］国家药典委員会.中华人民共和国药典（四部）［S］.北京：中国医药科技出版社，2020：通则26.

（收稿日期：2023-05-05 编辑：陶希睿）

作者简介：李兵兰（1986—），女，瑶族，本科，主管药师，研究方向为药品质量分析。E-mail：310409108@qq.com