HPLC法测定参梅养胃颗粒（无蔗糖）中羟基红花黄色素A的含量

路丽 张洪坤 黄玉瑶 郝建新 仲勇成 王利胜 董翼虎 高贯彪

【摘 要】 目的：建立HPLC法测定参梅养胃颗粒（无蔗糖）中羟基红花黄色素A的含量。方法：采用色谱柱ODS-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）为流动相等度洗脱；检测波长403 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL；流速1.0 mL/min。结果：羟基红花黄色素A在0.0480 ～0.7196 μg范围内线性关系良好，平均加样回收率（n=9）为101.74%， RSD值为1.6%。结论：该方法操作简便、准确、重复性好，测定结果稳定，可以作为参梅养胃颗粒（无蔗糖）中羟基红花黄色素A的含量测定方法。

【关键词】 参梅养胃颗粒（无蔗糖）；羟基红花黄色素A；含量测定；HPLC法

【中图分类号】R284.1   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2024）03-0041-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.03.zgmzmjyyzz202403010

Determination of Hydroxysafflower Yellow A in Shenmei Yangwei Granules （Without Sucrose） by HPLC

LU Li1，2 ZHANG Hongkun1，2* HUANG Yuyao1 HAO Jianxin3 ZHONG Yongcheng1

WANG Lisheng4 DONG Yihu5 GAO Guanbiao2

1. Sichuan Haoyun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangyuan 628017，China;

2.Bozhou Huqiao pharmaceutical industy limited company，Bozhou 236800， China;

3.Guangzhou Heyi Medical Technology Co.， Ltd.， Guangzhou 510970，China;

4.Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006，China;

5.Guangyuan Drug Inspection and Testing Center， Guangyuan 628017，China

Abstract：Objective To establish an HPLC method for the determination of hydroxysafflower yellow A in Shenmei Yangwei granules （without sucrose）.Methods Chromatographic column ODS-C₁₈ （4.6mm × 250mm，5 μm）， elute with methanol-acetonitrile-0.7% phosphoric acid solution （26：2：72） as the flow equivalent， detection wavelength： 403 nm，column temperature 25℃，injection volume 10 μL， the flow rate is 1.0 mL/min.Results Hydroxysafflower yellow A was 0.0480-0.7196 μg the linear relationship within the range of is good， the average recovery rate（n=9） is 101.74%， and the RSD value is 1.6%.Conclusion The method is simple， accurate， reproducible and stable. It can be used for the determination of hydroxysafflower yellow A in Shenmei Yangwei granules （without sucrose）.

Keywords：Shenmei Yangwei Granules （Without Sucrose）;Hydroxysafflower Yellow A;Content Determination;HPLC

參梅养胃颗粒（无蔗糖）由北沙参、山楂、乌梅、红花、丹参等十一味中药组成，具有养阴和胃之功效。临床用于胃痛灼热、嘈杂似饥、口咽干燥、大便干结、浅表性胃炎、胃阴不足型慢性胃炎及各种胃部不适症^［1］。方中北沙参、乌梅养阴生津止渴为君药；蒲公英清热解毒，红花、丹参、莪术、当归活血化瘀、凉血止痛、润肠通便为臣药；白芍、甘草养阴柔肝缓急止痛为佐；山楂、土木香健脾消食、行气止痛为使，诸药合用，共奏养阴和胃活血止痛之功，且治疗效果明显，值得临床推广使用。

现行参梅养胃颗粒质量标准中只有理化鉴别项，无含量测定项目，无法有效控制药物的内在质量^［2］。有研究者^［5-9］测定参梅养胃颗粒中的芍药苷、丹酚酸B、甘草苷和甘草酸铵等指标的含量，但是尚未有报道其中有效成分羟基红花黄色素A的含量测定研究。红花为方中臣药，具有活血化瘀、凉血止痛之功效，羟基红花黄色素A为其主要药效成分，具有抗炎镇痛的作用^［3-4］。笔者通过一系列的实验研究，首次运用HPLC法制定了参梅养胃颗粒（无蔗糖）中羟基红花黄色素A的含量测定方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器 安捷伦1260液相色谱系统；BP211D电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，d=0.1 mg）；JM-2CD-40液晶单频超声波清洗仪器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）；AXTG16B医用离心机（盐城市安信实验仪器有限公司）。

1.2 试药 羟甲基红花黄色素A（批号：111637-202111，含量96.8%，中国食品药品检定研究院）甲醇（色谱纯，Merck）；乙腈（色谱纯，Merck）；水为超纯水，其它试剂为分析纯。

样品： 北沙参 （批号220201）、 山楂 （批号220201）、 乌梅 （批号220301）、莪术（批号220201）、土木香（批号220201）、蒲公英（批号220201）、丹参（批号220301）、甘草（批号220302）、白芍（批号220201）、当归（批号220301）均购于四川省泓圃药业有限公司，上述药材均经四川豪运药业股份有限公司张洪坤副主任中药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ODS-C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液（26∶2∶72）；检测波长：403 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；流速：1.0 mL/min。理论板数按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。

2.2 对照品溶液的制备 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成每1 mL含0.125 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备 取本品约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率 480 W，频率40 kHz）40 min，取出，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性

2.4.1.1 溶剂空白溶液制备 25%甲醇溶液，滤过，取续滤液，即得。

2.4.1.2 阴性样品溶液制备（空白溶液） 取样品约2 g（除红花），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率 480 W，频率40 kHz）40 min，取出，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

2.4.1.3 辅料空白溶液的制备 取本品的辅料（糊精）2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入 25%甲醇 50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率 480 W，频率40 kHz）40 min，取出，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，离心（10000 r/min）10 min，取上清液，即得。

取“2.2”项下对照品溶液，“2.3”项下供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、溶剂空白溶液、阴性样品溶液及辅料空白溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。结果空白溶液及阴性样品均无干扰，表明方法专属性良好。如图1所示。

2.4.2 线性关系考察 对照品工作曲线溶液：分别移取“2.1”项下的对照品储备液0.4 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.2 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加25%甲醇至刻度，摇匀，即得浓度为每1 mL含羟基红花黄色素A 5 μg、12.5 μg、25 μg、40 μg、50 μg、75 μg、100 μg以及母液125 μg的系列对照品溶液。

精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，每个样品测定3次；最后以测得的响应信号对被测物的浓度函数作图，观察是否呈线性，再用最小二乘法进行线性回归，得回归方程Y=0.0349X-0.0113（R²=1）。结果表明，羟基红花黄色素A浓度在0.0480～0.7196 μg范围内，与峰面积线性关系良好。

2.4.3 精密度试验 取“2.4.2”项下25 μg/mL浓度的对照品溶液，按“2.1”项下色谱方法连续进样6次测定，记录羟基红花黄色素A的峰面积，结果峰面积RSD值为0.4%，说明仪器精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取同一批樣品6份，每份约2 g，精密称定，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，测定其峰面积。计算6份样品的平均含量为0.48 mg/g，RSD值为0.5%，结果表明该方法的重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 取已知羟基红花黄色素A含量的样品约1 g，共9份，每3份为一组，共3组，每组加入羟基红花黄色素A对照品，加入量与所取供试品（1g样品）中待测定成分量之比分别为（1.5∶1）、（1∶1）、（0.5∶1），按“2.3”项下制备供试品溶液的方法制备9份供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。计算平均回收率为101.74%， RSD值为1.6%。结果符合相应浓度下的准确度的要求。实验结果见表1。

2.4.6 检测限和定量限 配制一系列低浓度的对照品溶液，分别为0.0999 μg/mL、 0.1998 μg/mL、0.2997 μg/mL、 0.3996 μg/mL、 0.4496 μg/mL、0.4995 μg/mL。精密吸取上述不同浓度的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定；记录峰高值。以样品峰高高度明显大于2～3倍溶剂空白样品基线高度的相应浓度（或）量作为检出限，以10倍以上空白样品噪音基线高度的相应量为定量限。结果显示，检测限为0.000999 μg，定量限为0.004496 μg。

2.4.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、24 h进样分析，考察供试品溶液稳定性。结果，供试品溶液0～24 h测定的羟基红花黄色素A色谱峰面积RSD为2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.8 耐用性考察 对不同色谱柱、不同柱温、不同流速、不同检测波长及不同浓度流动相进行分析考察含量测定方法耐用性。结果显示各考察因素下的目标峰分离度、对称因子、灵敏度、理论塔板数等均符合要求，且不同考察因素下测定羟基红花黄色素A含量的RSD分别为2.0%、2.3%、3.2%、1.2%、1.2%，表明该含量测定方法的耐用性良好。结果见表2。

2.5 含量测定 取不同来源和批次的参梅养胃颗粒（无蔗糖），按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算样品中羟基红花黄色素A的含量。结果见表3。

3 讨论

3.1 供试品溶液的制备 在参梅养胃颗粒（无蔗糖）供试品溶液的制备中，以羟基红花黄色素A的含量为指标，系统考察了提取溶剂（水、25%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇）、提取方式（超声、回流、冷浸）、提取次数（超声处理1次、2次、3次）和时间（40 min、50 min、60 min）对提取率的影响，测定结果显示，采用25%甲醇 50 mL超声处理（功率 480 W，频率 40 kHz）40 min的方法，提取效率较高，同时提取时间较短，且方法操作简便，故选用此制备方法。

3.2 检测波长的选择 在190～600 nm的紫外区进行在线检测，羟基红花黄色素A在403 nm处有最大吸收，峰纯度因子996，因此选择403 nm作为参梅养胃颗粒（无蔗糖）中羟基红花黄色素A指标成分含量测定的检测波长。

本实验建立HPLC法测定参梅养胃颗粒（无蔗糖）的羟基红花黄色素A的含量，该方法操作简便、准确、重复性好、耐用性好，测定结果稳定，可以作为参梅养胃颗粒（无蔗糖）的羟基红花黄色素A含量的测定方法。由含量测定结果可知，自制样品的羟基红花黄色素A含量为2.65～3.15 mg/袋，市售样品中的羟基红花黄色素A含量为0.00～0.03 mg/袋，两者含量存在显著差异，考虑跟生产工艺以及羟基红花黄色素A的稳定性差有关。在参梅养胃颗粒（无蔗糖）的生产过程中涉及加热提取浓缩等步骤，此过程会导致羟基红花黄色素A产生一定的分解从而影响其含量。有研究^［10-12］表明光照、温度、湿度等对羟基红花黄色素A的稳定性影响比较大，当温度高于60 ℃，加热一定时间后，羟基红花黄色素A就会发生水解；在避光条件下，羟基红花黄色素A有较好的稳定性。所以在参梅养胃颗粒（无蔗糖）的生产过程中需要特别注意生产工艺过程中加热提取的温度等参数对其含量的影响，同时对原料的质量把控也是至关重要的。

考虑参梅养胃颗粒的现行质量标准中只有理化鉴别项，无含量测定项目，无法有效控制药物的内在质量，所以质量标准的提高迫在眉睫，建立有效成分的含量测定指标有助于控制产品质量，由此可见对参梅养胃颗粒（無蔗糖）中羟基红花黄色素A的质量标准建立具有重要意义。

参考文献

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（收稿日期：2023-05-05 编辑：陶希睿）

作者简介：路丽（1990—），女，汉族，硕士，主管中药师，研究方向为中药研发及其质量评价研究。E-mail：754513018@qq.com

通信作者：张洪坤（1986—），男，汉族，硕士，副主任中药师，研究方向为中药研发及其质量评价研究。E-mail：hennanji@yeah.net