UPLC-MS/MS法测定心可舒胶囊中木香烃内酯与去氢木香内酯的含量*

吴洋生 蒋 玲 周云峰 黄招光△

心可舒胶囊由葛根、山楂、三七、丹参和木香5味中药组成,具有活血化瘀、行气止痛的功效[1],临床主要用于治疗气滞血瘀型冠心病引起的头痛、胸闷、高血压病、心绞痛、头晕、颈项疼痛及心律失常、高血脂等症[2,3]。心可舒胶囊方中木香为佐使药,具有行气止痛的功效[4],其主要的代表性成分为木香烃内酯与去氢木香内酯,属于倍半萜内酯类化合物,具有抗炎、抗肿瘤、降血糖、解痉等作用[5-8]。心可舒胶囊的现行标准为《药品标准·中药成方制剂》[2],该标准只对木香进行薄层鉴别,方法专属性不高,可能无法有效知悉木香的真实投料情况,有必要对其含量测定方法进行研究。目前,涉及心可舒胶囊含量测定的研究主要集中在葛根[9]、山楂[10]、三七[11]、丹参[1],而对该制剂中木香的含量方法的报道甚少,基于此,本研究首次采用UPLC-MS/MS法建立木香中木香烃内酯与去氢木香内酯的含量测定法,报道如下。

1 仪器与材料

沃特世H-class超高效液相-xevo TQD三重串联四级杆质谱系统(美国waters公司);KH-250DB超声波清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司)。

木香烃内酯(批号:111524-201208,纯度:99.5%)、去氢木香内酯对照品(批号:111525-201912,纯度:99.5%)、木香对照药材(批号:120921-202010)购于中国食品药品检定研究院;山楂(批号:220301,安徽民顺堂中药科技有限公司)、丹参(批号:220801,江西九州堂中药饮片有限公司)、三七(批号:190801,湖南省松龄堂中药饮片有限公司)、葛根(批号:220901,江西九州堂中药饮片有限公司)用于制备缺木香的阴性样品;乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯,水为屈臣氏蒸馏水。心可舒胶囊样品(市售3批,来源于四川百草堂龙人药业有限公司,规格为0.3 g/粒)。

2 方法与结果

2.1 检测条件0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)为流动相,梯度洗脱(0～2 min,20%B～20%B;2～6 min,20%B～80%B;6～9 min,80%B～80%B;9～10 min,80%B～20%B;10～13 min,20%B～20%B),流速0.3 ml/min;色谱柱:Waters ACQUITY UPLC©BEH C18;柱温:35 ℃;进样量:2 μl。质谱条件为电喷雾离子源ESI、多反应监测模式(MRM)、正离子电离模式;毛细管电压为0.5 kV,锥孔电压为24 V,雾化气流速为900 L/h,温度 550 ℃;木香烃内酯检测离子对m/z 233→105、m/z 233→187、m/z 233→215;去氢木香内酯检测离子对m/z 231→128、m/z 231→143、m/z 231→185。

2.2 对照品溶液取木香烃内酯、去氢木香内酯对照品适量,精密称定,加甲醇溶解配成含木香烃内酯2.1498 μg/ml、去氢木香内酯2.1970 μg/ml的对照品混合母液。

2.3 供试品溶液取装量差异项下的样品约0.3 g,精密称定,置于250 ml锥形瓶中,精密加入100 ml甲醇,称定重量,常温超声处理35 min,放冷至室温,用甲醇补充减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液5～50 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得。

2.4 阴性样品溶液取木香的阴性样品约0.3 g,按2.3项下方法制备阴性样品溶液。

2.5 对照药材溶液取木香对照药材约25 mg,按2.3项下方法制备对照药材溶液。

2.6 标准曲线精密量取对照品混合母液1 ml、2 ml、5 ml、15 ml、25 ml分别置50 ml量瓶中,加甲醇稀释配制成一系列浓度的对照品溶液,按照2.1项下检测条件测定,记录峰面积,以对照品浓度为横坐标(X),以峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线得出木香烃内酯的回归方程为Y=25386X+1057.2,R2=0.9913;去氢木香内酯的回归方程为Y=5036.9X+331.6,R2=0.9946。

2.7 专属性分别取阴性样品溶液、木香对照药材溶液、供试品溶液、对照品溶液各2 μl,依次进行检测,采集MRM图。结果显示,供试品溶液出现与木香对照药材溶液、对照品溶液保留时间一致的色谱峰,而在阴性样品溶液的色谱中均未有与木香烃内酯和去氢木香内酯对照品溶液保留时间一致的离子峰,说明该2种成分归属于木香药味,且该制剂中其他药味成分对测定无影响,专属性良好。见图1。

图1 总离子流色谱图

2.8 精密度 重复性 稳定性取一份木香烃内酯浓度为0.2150 μg/ml、去氢木香内酯浓度为0.2197 μg/ml的对照品溶液,连续进样6次,记录峰面积,木香烃内酯和去氢木香内酯的峰面积RSD分别为1.6%和2.0%;平行称取6份样品(批号:01221101),制备供试品溶液,测定含量,木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD为3.6%和2.2%;取重复性项下的一份供试品溶液,在0 h、2 h、4 h、8 h、16 h测定峰面积,木香烃内酯和去氢木香内酯的RSD分别为4.9%和4.0%。

2.9 加标回收平行称取6份样品(批号:01221101),每份约0.15 g,精密称定,置于250 ml锥形瓶中,精密加入混合对照品溶液4 ml(木香烃内酯浓度为0.2150 mg/ml,去氢木香内酯浓度为0.2197 mg/ml),再精密加入甲醇96 ml,按2.3项下方法制备加标样品溶液,计算回收率结果。见表1。

表1 加标回收率

2.10 样品结果取该厂家3批心可舒胶囊,每批称取2份平行样,分别按照2.3项下方法制备供试品溶液,含量测定结果见表2。

表2 心可舒胶囊中木香烃内酯和去氢木香内酯含量结果

3 讨论

UPLC-MS/MS技术具有灵敏度高、分析速度快、选择性强等特点,在中药质量控制,尤其是定量测定方面越来越发挥着至关重要的作用[12,13]。本实验初期采用水和乙腈、水和甲醇作为流动相,以正、负离子扫描模式分别对木香烃内酯和去氢木香内酯的质谱响应进行摸索,发现该2种成分的响应强度均较低且出现峰形拖尾情况,而在水相中加入了0.1%甲酸后,木香烃内酯和去氢木香内酯在正离子扫描模式下出现较高响应,且色谱峰峰形尖锐对称,考虑到乙腈具有较好的分离性,最终选择0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相,并以梯度洗脱方式减少极性和非极性杂质在色谱柱中的残留及对测定的干扰。

木香烃内酯检测离子对为m/z 233→187,去氢木香内酯检测离子对为m/z 231→185,其裂解规律为在正离子电离模式下,木香烃内酯的母离子为m/z 233[M+H]+,失去一分子甲酸得到子离子m/z 187[M+H-HCOOH]+;去氢木香内酯的母离子为m/z 231[M+H]+,失去一分子甲酸产生子离子m/z 185[M+H-HCOOH]+。

木香烃内酯和去氢木香内酯不溶于水,可溶于甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮等溶剂中,综合考虑溶剂的挥发性、对仪器系统的兼容性和稳定性等因素,选择甲醇作为样品的提取溶剂。木香烃内酯和去氢木香内酯具有热不稳定性,采用加热回流等方式提取可能会使上述2种成分加速水解,影响结果准确性,故直接考察在常温下(不高于25 ℃)超声时间对提取效果的影响,通过比较不同超声时间发现35 min后木香烃内酯和去氢木香内酯即可提取完全。

从含量测定结果可知,各批次样品中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量差异较小,含量均一性较好,说明该企业的生产工艺较稳定,且木香药味的进货来源相对可控。

综上所述,本研究所建立的UPLC-MS/MS法快速、准确,可用于测定心可舒胶囊中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量,对控制木香药味的质量具有重要作用。