慢性阻塞性肺疾病小鼠益气固表丸灌胃后内脏脂肪堆积及代谢性炎症反应观察

梁倩倩，荆晶，徐丹，王晶，姜敏，李争，，3，4

1 新疆医科大学第四临床医学院，乌鲁木齐 830000；2 新疆国家中医药临床研究基地；3 新疆呼吸疾病研究重点实验室；4 新疆呼吸阻塞性肺疾病临床医学研究中心

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种全身系统性、慢性持续性炎症疾病，其特征是不可逆和进行性气流阻塞。COPD患者常常合并高脂血症、肥胖等代谢紊乱性疾病，肥胖是其常见的共患疾病［1］。COPD患者易发生内脏脂肪异常堆积，而内脏脂肪的堆积会导致机体发生代谢性炎症反应，引起慢性炎症性疾病的发生和加重，如冠心病、高血压、糖尿病等［2］。脂肪组织由皮下脂肪和内脏脂肪构成，脂肪细胞分为白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞和米色脂肪细胞，而内脏脂肪主要由白色脂肪细胞构成，分布在附睾、肾周、肠系膜等部位。白色脂肪细胞棕色化能够产生能量、消耗热量，减少内脏脂肪异常堆积，从而减轻机体代谢性炎症水平，对于延缓COPD的疾病进程具有重要意义。益气固表丸是我院呼吸科经过多年临床经验的总结和积累研制而成的院内制剂，主要应用于COPD稳定期患者的治疗。研究显示，益气固表丸能够降低COPD患者的体脂率、减少其内脏脂肪面积［3］，但是其对COPD患者白色脂肪棕色化及代谢性炎症反应的影响尚未可知。2022年7月—2023年9月，本研究观察了益气固表丸对COPD小鼠内脏脂肪堆积及代谢性炎症反应的影响，观察其机制是否与调控白色脂肪棕色化及棕色脂肪细胞激活有关，为中医药防治COPD提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：C57BL/6雄性小鼠30只，8周龄，体质量18～22 g，购自新疆医科大学动物中心，生产许可证号SYCK（新）2018.0002，使用许可证号SYCK（新）2018.0003，本研究通过新疆医科大学实验动物伦理委员会批准（IACUC-20211104-30）。药物：益气固表丸购自新疆医科大学附属中医院。主要试剂：白色脂肪棕色化相关指标沉默信息调节因子1（SIRT1）、酶偶联蛋白1（UCP1）、过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1α（PGC-1α）抗体及HRP标记的山羊抗兔IgG二抗均购自英国Abcam公司，过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、β-actin抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司，PR结构域蛋白16（PRDM16）抗体购自美国CST公司；炎症反应相关指标肿瘤坏死因子α（TNF-α）抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，白细胞介素6（IL-6）抗体购自上海碧云天生物科技有限公司，白细胞介素8（IL-8）抗体购自上海爱必信生物科技有限公司。主要仪器：Tanon 4600系列全自动化学发光/荧光图像分析系统购自上海天能科技有限公司，LightCycler®96型实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司。

1.2 COPD模型建立及益气固表丸给药方法 将30只C57BL/6雄性小鼠随机分为空白对照组、COPD组、益气固表丸组，每组10只。COPD组、益气固表丸组采用吸入香烟烟雾暴露联合香烟烟雾提取物（CSE）腹腔注射的方法建立小鼠COPD模型［4］：将小鼠置于烟草烟雾室中，同时点燃5支香烟、持续暴露于香烟烟雾中15 min，打开盖子让动物休息5 min，结束1个暴露周期；第1、12、23天只需1个暴露周期，同时腹腔注射CSE 0.3 mL/20 g，共28 d。空白对照组仅同时间点腹腔注射PBS 0.3 mL/20 g。将益气固表丸以500丸/500 mL生理盐水的比例进行溶解，益气固表丸组于造模第29天给予200 μL灌胃，1次/天，连续2周；空白对照组及COPD组给予等体积生理盐水灌胃。

1.3 Lee's指数及脂体比测算 各组小鼠分组处理后称取体质量，腹腔注射1%戊己比妥纳100 mg/kg进行麻醉，仰卧平放，用游标卡尺测量小鼠鼻尖至肛门的长度（记为体长），Lee's指数 = 体质量（g）1/3×1 000/体长（cm）。使用大头针眼球取血，挤压滴至EP管中，3 000 r/min离心15 min，取上层血清于1.5 mL无菌EP管中，-80 ℃冷冻保存。将各组小鼠断颈后处死，收集内脏（附睾、肾周、肠系膜）脂肪组织并称取质量，脂体比 = 内脏脂肪组织质量/体质量 ×100%；分别收集左肺组织、附睾周围的白色脂肪组织和肩胛间区的棕色脂肪组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切片。

1.4 肺组织和白色、棕色脂肪组织病理观察 采用HE染色。将各组肺组织和白色、棕色脂肪组织石蜡切片依次脱蜡，梯度乙醇脱水。置入苏木素染液中染色3～5 min，分化液分化、返蓝液返蓝后流水冲洗。将切片依次置入85%、95%的梯度乙醇中脱水各5 min，置入伊红染液中染色5 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察肺组织病理变化及脂肪组织形态变化。

1.5 白色脂肪组织棕色化及炎症反应相关指标蛋白检测 采用Western blotting法。取各组小鼠附睾周围的白色脂肪组织，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上静置30 min。13 000 r/min离心15 min（离心半径15 cm），取上清移至另一离心管。使用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度，将等量变性蛋白进行SDS-PAGE电泳后分离，转移至活化的PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h。加入SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16、TNF-α、IL-6、IL-8及内参β-actin一抗，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜10 min ×5次。加入相应的山羊抗兔或抗鼠二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜10 min × 5次。加入ECL化学发光显影液，凝胶成像系统曝光成像。Image J软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.6 白色和棕色脂肪组织UCP1蛋白检测 采用免疫荧光法。取各组部分白色和棕色脂肪组织石蜡切片，脱蜡至水，脱蜡脱水后蒸馏水洗，抗原修复后自然冷却。加入牛血清白蛋白室温封闭，滴加UCP1抗体，切片平放于湿盒内，4 ℃孵育过夜。加入对应的二抗，避光室温孵育50 min；脱色摇床上晃动，PBS洗涤5 min × 3次。加入DAPI染液复染细胞核，避光室温孵育10 min。加入自发荧光淬灭剂B液5 min，流水冲洗10 min。封片后将玻片置于扫描仪下采集图像，荧光显微镜下显示红色荧光的区域定义为UCP1抗体阳性，采用Image J软件分析UCP1相对荧光强度。

1.7 白色脂肪组织TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA检测采用实时荧光定量PCR法。取附睾周围的白色脂肪组织，加入TRIzol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA。以β-actin为内参，使用特定TaqMan荧光探针进行荧光定量PCR检测。采用2-ΔΔCt法计算TNF-α、IL-6、IL-8 mRNA相对表达量。

1.8 血清IL-6、IL-8、TNF-α检测 采用ELISA法。取各组小鼠的眼球血血清，严格按照IL-6、IL-8、TNF-α ELISA试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪测量450 nm波长处的光密度（OD）值。

1.9 统计学方法 采用SPSS26.00统计软件。计量资料采用S-W法检验正态性，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠Lee's 指数、脂体比比较 与空白对照组比较，COPD组小鼠Lee's指数及脂体比均升高（P均＜0.05）；与COPD组比较，益气固表丸组小鼠Lee's指数及脂体比均降低（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠Lee's 指数、脂体比比较（± s）

表1 各组小鼠Lee's 指数、脂体比比较（± s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与COPD组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组COPD组益气固表丸组脂体比（%）1.00 ± 0.19 1.63 ± 0.29*1.10 ± 0.12#n 10 10 10 Lee's 指数87.94 ± 1.69 100.10 ± 5.49*91.55 ± 2.73#

2.2 各组小鼠肺组织病理情况比较 空白对照组小鼠肺脏表面被覆一层光滑的浆膜，无明显异常；肺脏实质为肺内支气管各级分支及其终末的大量肺泡，各级支气管结构无明显异常，肺泡壁由单层上皮组成，结构清晰；间质包括肺内结缔组织及血管等，均无明显异常；未见明显的炎症细胞浸润。COPD组小鼠肺组织可见较大面积肺泡壁轻度增厚，肺泡间隔增宽，伴有少量粒细胞浸润，肺泡大小不一，部分肺泡狭窄，部分肺泡代偿性扩张；血管周围可见少量淋巴细胞散在浸润，局部肺泡腔内可见少量游离的巨噬细胞、粒细胞。益气固表丸组小鼠肺脏组织可见小面积肺泡壁增厚，较COPD组肺泡间隔缩短、炎症细胞浸润情况减轻。见OSID码图1。

2.3 各组小鼠白色、棕色脂肪组织形态学比较 与空白对照组比较，COPD组白色、棕色脂肪组织内的脂肪细胞体积均增大，细胞内空泡均增多；与COPD组比较，益气固表丸组白色、棕色脂肪组织内的脂滴减小，呈现出棕色化表现。见OSID码图2。

2.4 各组小鼠白色脂肪组织棕色化及炎症反应相关指标蛋白表达比较 与空白对照组比较，COPD组小鼠白色脂肪组织SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白相对表达量均降低，TNF-α、IL-6、IL-8蛋白相对表达量均升高（P均＜0.05）。与COPD组比较，益气固表丸组小鼠白色脂肪组织SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白相对表达量均升高，TNF-α、IL-6、IL-8蛋白相对表达量均降低（P均＜0.05）。见表2、OSID码图3。

表2 各组小鼠白色脂肪组织棕色化及炎症反应相关指标蛋白相对表达量比较（± s）

表2 各组小鼠白色脂肪组织棕色化及炎症反应相关指标蛋白相对表达量比较（± s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与COPD组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组COPD组益气固表丸组TNF-α 1.00 ± 0.07 1.54 ± 0.12*0.93 ± 0.07#n 10 10 10 SIRT1 0.45 ± 0.20 0.17 ± 0.04*1.32 ± 0.09*PPARγ 0.67 ± 0.02 0.48 ± 0.08*0.62 ± 0.09#UCP1 1.18 ± 0.05 0.33 ± 0.06*0.98 ± 0.34#PGC-1α 1.00 ± 0.12 0.63 ± 0.10*1.23 ± 0.14#PRDM16 1.10 ± 0.16 0.70 ± 0.05*1.11 ± 0.10#IL-6 0.42 ± 0.16 1.05 ± 0.20*0.60 ± 0.04#IL-8 0.62 ± 0.02 1.16 ± 0.09*0.88 ± 0.10*#

2.5 各组小鼠白色、棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度比较 与空白对照组比较，COPD组小鼠白色、棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度均降低（P均＜0.05）。与COPD组比较，益气固表丸组小鼠白色、棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度均升高（P均＜0.05）。见表3及OSID码图4、5。

表3 各组小鼠白色、棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度比较（± s）

表3 各组小鼠白色、棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度比较（± s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与COPD组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组COPD组益气固表丸组n 棕色脂肪组织1.00 ± 0.06 0.38 ± 0.06*1.27 ± 0.16*#10 10 10 UCP1相对荧光强度白色脂肪组织1.00 ± 0.05 0.47 ± 0.04*0.74 ± 0.04*#

2.6 各组小鼠白色脂肪组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达比较 与空白对照组比较，COPD组小鼠白色脂肪组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量均升高（P均＜0.05）。与COPD组比较，益气固表丸组小鼠白色脂肪组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量均降低（P均＜0.05）。见表4。

表4 各组小鼠白色脂肪组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量比较（± s）

表4 各组小鼠白色脂肪组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA相对表达量比较（± s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与COPD组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组COPD组益气固表丸组TNF-α mRNA 1.01 ± 0.17 2.73 ± 0.44*1.04 ± 0.19#n 10 10 10 IL-6 mRNA 1.01 ± 0.17 36.38 ± 5.45*5.94 ± 1.05*#IL-8 mRNA 1.01 ± 0.14 3.92 ± 0.62*2.50 ± 0.54*#

2.7 各组小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比较 与空白对照组比较，COPD组小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均升高（P均＜0.05）；与COPD组比较，益气固表丸组小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均降低（P均＜0.05）。见表5。

表5 各组小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比较（pg/mL，± s）

表5 各组小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α水平比较（pg/mL，± s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与COPD组比较，#P＜0.05。

组别空白对照组COPD组益气固表丸组TNF-α 17.89 ± 2.88 109.40 ± 5.10*30.58 ± 6.75*#n 10 10 10 IL-6 3.89 ± 0.22 6.88 ± 0.86*5.46 ± 0.42*#IL-8 10.98 ± 1.64 21.44 ± 1.59*13.03 ± 3.91#

3 讨论

既往观点认为，COPD患者基础代谢率升高、分解代谢亢进可导致患者出现营养不良和体质量降低［5］。但是近年有研究指出，COPD患者中肥胖/超重的比例升高，表现为四肢肌肉减少合并体脂含量升高，以向心性肥胖主要特征［6］。COPD是一种系统性、慢性炎症疾病，以内脏脂肪过度堆积为特点的腹部肥胖是其主要特征，肥胖可促进机体代谢性炎症反应，引发多种慢性疾病的发生。本课题组前期研究显示，内脏脂肪组织指数（VAI）与用力肺活量（FVC）、第1秒用力呼气量（FEV1）呈倒U型曲线关系，当VAI≥15时二者随着VAI的升高而降低，这与近年来所提出的“肥胖悖论”存在一致性，可能与内脏脂肪组织过度堆积引发机体持续慢性低度炎症反应有关［2，7］。

内脏脂肪组织主要由白色脂肪组织组成，脂肪细胞具有可逆性表型重新编程的能力，在特定（如寒冷刺激、运动、药物、过度能量摄入）情况下，白色脂肪细胞会高表达UCP1，转变为棕色样的产热细胞来消耗人体摄入的过多能量，从而维持机体能量平衡，该过程称为“白色脂肪棕色化”［8］。本研究结果显示，COPD组较空白对照组小鼠脂体比和Lee's指数升高，白色、棕色脂肪细胞体积增大，细胞内空泡及脂滴含量增多，这提示COPD小鼠存在内脏脂肪堆积和棕色脂肪活性被抑制；COPD组白色、棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度较空白对照组下降，提示COPD模型小鼠对脂滴的消耗功能下降，这可能是造成COPD小鼠内脏脂肪过度堆积的重要原因之一。本研究结果显示，COPD小鼠白色脂肪组织TNF-α、IL-6、IL-8蛋白、mRNA相对表达量及血清水平均升高，提示COPD小鼠内脏脂肪过度堆积与体内炎症水平升高有关。因此，COPD患者体内维持能量平衡的途径可能受到抑制，从而导致白色脂肪组织过度堆积，引发白色脂肪细胞和免疫细胞之间相互作用，使机体产生持续低度代谢性炎症反应，最终可能导致气道高反应状态，甚至气道重塑的发生［9-13］。

白色脂肪棕色化的调节过程涉及复杂的调控网络，多种转录因子与信号通路参与其中，其中PPARγ在白色脂肪棕色化中的研究最为深入［14］。PPARγ是细胞核激素受体家族的一种活性配体转录蛋白，SIRT1可通过促进PPARγ去乙酰化引起白色脂肪棕色化，从而抑制脂肪组织储存，并促进脂解以释放脂肪酸［15］。SIRT1是一种NAD+依赖的蛋白质去乙酰化酶，参与调控脂质代谢、脂肪细胞分化、炎症、细胞凋亡和衰老等过程［16］。UCP1、PGC-1α、PRDM16是棕色脂肪细胞分化的决定因子，也是促进白色脂肪棕色化的关键因子［17-19］。UCP1是一种特定的棕色脂肪细胞标志物，通过解偶联三磷酸腺苷（ATP）合成的氧化磷酸化来调节棕色脂肪组织的产热过程，是参与细胞产热和能量消耗的直接蛋白［20-21］。PGC-1α是PPARγ转录共激活因子，可介导线粒体氧化，并上调棕色脂肪组织UCP1蛋白表达［22］。PPARγ能增加白色脂肪组织中线粒体生物合成，以及棕色脂肪相关基因UCP1和PGC-1α表达，同时能够募集PRDM16发挥能量消耗作用，最终促进白色脂肪棕色化［23］。本研究结果显示，COPD组较空白对照组白色脂肪组织SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白表达均下降，同时IL-6、IL-8、TNF-α蛋白表达升高，这提示可能由于COPD小鼠白色脂肪组织SIRT1低表达，抑制了PPARγ活性，从而导致UCP1、PGC-1α、PRDM16表达下降，阻碍了白色脂肪棕色化及能量消耗过程，引起内脏脂肪异常堆积及高代谢性炎症状态。本研究结果显示，益气固表丸组较COPD组脂体比和Lee's指数均降低，白色脂肪细胞体积及脂滴减小，呈现出棕色化表现，棕色脂肪组织也表现出细胞活化状态，这提示益气固表丸可以促进COPD小鼠白色脂肪棕色化过程；益气固表丸组较COPD组白色脂肪组织中SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16表达均升高，IL-6、IL-8、TNF-α表达均下降。这提示益气固表丸可能通过SIRT1/PPARγ/UCP1信号通路上调UCP1、PGC-1α、PRDM16表达，启动能量消耗，促进白色脂肪棕色化过程，抑制COPD小鼠内脏脂肪堆积的同时也降低其代谢性炎症水平。

综上所述，益气固表丸可减轻COPD小鼠的内脏脂肪堆积及代谢性炎症反应，其机制可能与靶向SIRT1/PPARγ/UCP1信号通路而促进白色脂肪棕色化有关。今后本课题组将进一步明确益气固表丸对COPD异常脂肪堆积的调控作用，及其对SIRT1/PPARγ/UCP1信号通路分子之间的调控互作关系，深入探讨益气固表丸改善COPD慢性炎症及相关代谢紊乱的作用机制。